Modulation der Gαi1/s-Proteinaktivität durch lineare und makrozyklische Peptide

Abstract

Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Identifizierung und Charakterisierung von peptidischen Modulatoren für die G&alpha;i/s-Proteinaktivität. Die Ga-Untereinheit heterotrimerer G-Proteine ist eine bedeutende pharmakologische Zielstruktur, da diese G-Proteine an diversen (patho )physiologischen Prozessen beteiligt sind. Die Ga-Untereinheit fungiert dabei als molekularer Schalter und besitzt Kontaktregionen an der Proteinoberfläche, die zahlreiche Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) mit Signaltransduktionspartnern vermitteln. Bisher existieren selektive Modulatoren nur für eine der vier Ga-Subfamilien (Gas, G&alpha;i, Gaq und Ga12/13), und zwar Gaq. <br /> In der vorliegenden Arbeit wurden durch Screeningexperimente mit zwei kombinatorischen Peptidbibliotheken lineare und bizyklische Peptide als potentielle Kandidaten für die Modulation der G&alpha;i/s-Proteinaktivität identifiziert. Nach Ableitung von Konsensussequenzen wurden 13 lineare und 18 bizyklische Hits als ausgewählte Vertreter synthetisiert und analytisch charakterisiert. Aus der Serie der linearen Peptide wurde insbesondere GPM-1 als hoch-affiner G&alpha;i1-Binder identifiziert, welcher sequentielle Ähnlichkeiten zu bereits literaturbekannten G&alpha;i/s-Bindern und dem GEM (Guaninnukleotidaustauschmodulator)-Motiv von Proteinen mit einer GEM-Aktivität aufweist. Dieses Peptid wurde im Folgenden mit der Intention optimiert, die Zellpermeabilität und die proteolytische Stabilität zu erhöhen. In funktionellen Studien stellten sich die beiden Derivate GPM-1c und GPM-1d als aktiver im Vergleich zur Leitstruktur heraus und zeigten einen GEM-ähnlichen Effekt in einem zellfreien und einem zellbasierten Ansatz. Die experimentellen Ergebnisse wurden durch computerbasierte Analysen bekräftigt, welche zudem Einblicke in die Struktur-Wirkungs-Beziehungen lieferten. Darüber hinaus wurden die G&alpha;i/s-Kontaktflächen auf ihre Zugänglichkeit analysiert, um strukturelle Determinanten für die zukünftige Entwicklung von G&alpha;i/s-Proteinmodulatoren zu definieren. Daraus wurde, in Kombination mit den in dieser Arbeit erhaltenden Ergebnissen, die Switch II/a3-Region als Zielregion für die weitere Entwicklung von neuen, aber auch bereits bestehenden Modulatoren vorgeschlagen. Zudem wurden die 18 bizyklischen Hits für die funktionellen Studien mit dem zellfreien und zellbasierten Ansatz bereitgestellt. <br /> Die vorliegende Dissertation liefert substanzielle Beiträge für die Entwicklung von peptidischen Modulatoren der G&alpha;i/s-Proteinaktivität und Einblicke in deren Struktur-Wirkungs-Beziehungen. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen kann die GPM-1-Leitstruktur sowie die optimierten Derivate GPM-1c und GPM-1d als chemische Werkzeuge in pharmakologischen Studien dienen und für die biomedizinische Anwendung und die pharmakologische Forschung weiterentwickelt werden. Diese Dissertation trägt somit dazu bei, neue Einblicke in die G-Protein-vermittelte Signaltransduktion und damit zusammenhängende Krankheitsbilder zu erhalten. Die Arbeit könnte demnach einen weiteren Forschungsfortschritt ermöglichen, mit dem Ziel, die als „undruggable“ beschriebene Ga-Untereinheit in der Zukunft als „druggable“ zu etablieren.

<strong> Modulation of G&alpha;i1/s protein activity by linear and macrocyclic peptides </strong>

<br /> The present dissertation focuses on the identification and characterization of peptidic modulators for the G&alpha;i/s protein activity. The Ga subunit of heterotrimeric G proteins is an interesting pharmacological target structure, since these G proteins are involved in diverse (patho )physiological processes. In this context, the Ga subunit acts as a molecular switch and exhibits contact sites on the protein surface that mediate numerous protein-protein interactions (PPIs) with signal transduction partners. To date, selective modulators only exist for one of the four Ga subfamilies (Gas, G&alpha;i, Gaq, and Ga12/13), namely Gaq. <br /> In the present thesis, screening experiments with two combinatorial peptide libraries were conducted to identify linear and bicyclic peptides as potential candidates for the modulation of the G&alpha;i/s protein activity. After derivation of consensus sequences, 13 linear and 18 bicyclic hits were synthesized as representatives and characterized analytically. From the linear peptides, GPM-1 was obtained as a high-affinity G&alpha;i1 binder, which exhibits sequential similarities to previously reported G&alpha;i/s binders and the GEM (guanine-nucleotide exchange modulator) motif of proteins possessing a GEM activity. This peptide was subsequently optimized with the intention of increasing the cell permeability and the proteolytic stability. In functional studies, the two GPM-1 derivatives, GPM-1c and GPM-1d, turned out to be more active than the lead structure and showed a GEM-like activity in a cell-free approach and in a whole cell assay. The experimental results were supported by computer-based analyses, which also provided insights into the structure-activity relationships. Furthermore, the G&alpha;i/s contact sites were analyzed for their accessibility to define structural determinants for the development of G&alpha;i/s protein modulators in the future. In combination with the results obtained in this thesis, the Switch II/a3 region was proposed as a target region for the further development of existing or new binders/modulators. In addition, the 18 bicyclic hits were provided for the functional studies using the cell-free approach and the whole cell assays. <br /> The present dissertation contributes substantively to the development of peptidic modulators for the G&alpha;i/s protein activity and provides insights into their structure-activity relationships. Based on the obtained results, the GPM-1 lead structure as well as the optimized GPM-1c and GPM-1d can serve as chemical tools in pharmacological studies and can be further developed for biomedical application and pharmacological research. This dissertation contributes to provide new insights into G protein-mediated signal transduction and related pathologies. Consequently, this work could enable further research progress with the goal of rendering the "undruggable" Ga subunit "druggable" in the future.