Analyse von periplasmatischen Schwefeltransferasen aus <em>Allochromatium vinosum</em>

Abstract

Die ersten Schritte der Schwefeloxidation in Allochromatium vinosum finden im Periplasma statt, wo reduzierte Schwefelverbindungen oxidiert und in diesem Zuge Schwefelkugeln aufgebaut werden. Es ist denkbar, dass periplasmatische Schwefeltransferasen bei dem Transfer von Schwefelverbindungen zu den Schwefelkugeln eine wesentliche Rolle spielen, da sie in der Lage sind, die Bildung und Umformung von sulfanschwefelhaltigen Verbindungen zu katalysieren. <br /> Diese Arbeit bietet neue Einblicke in die strukturellen Eigenschaften und katalytischen Funktionen der periplasmatischen Schwefeltransferase Alvin_0258 und des membrangebundenen Enzyms Alvin_3028. Beide Schwefeltransferasen binden den Sulfanschwefel mehrerer Substrate, wie Thiosulfat oder Glutathionpersulfid sowie von Polysulfiden und transferieren diesen in vitro zu einem Akzeptor. Mittels Reporterprotein-Fusionen konnte nach heterologer Überexpression in E. coli das katalytische Zentrum von Alvin_3028 im Cytoplasma lokalisiert werden. Die untersuchten mRNA-Level waren nur während der Oxidation von elementarem Schwefel im späteren Oxidationsverlauf erhöht, was für die Bereitstellung des Proteins während des Abbaus von Schwefelkugeln spricht. Die Inserierung von Antibiotika-Kassetten sowie in frame-Deletionsverfahren lieferten keine Alvin_3028 Mutanten, was eine Notwendigkeit des Proteins in Alc. vinosum, jedoch im Cytoplasma, andeutet. Im Gegensatz dazu ist Alvin_0258, neben SoxL, die einzige annotierte Rhodanese im Periplasma, welche vollständig charakterisiert wurde. Für Rhodanesen üblich erfolgt die Katalyse über einen „Ping-Pong“-Mechanismus und Alvin_0258 zeigte neben Thiosulfat eine erstaunlich hohe Affinität zu Polysulfiden. Obwohl in-frame Deletionsmutanten während des photolithoautotrophen Wachstums keine Unterschiede zum Wildtyp aufwiesen, waren die untersuchten mRNA Level zu Beginn der Oxidation von Sulfid, Thiosulfat und elementaren Schwefel deutlich erhöht. <br /> Im Periplasma wird die Oxidation von Thiosulfat unter anderem vom Sox System katalysiert, dessen Analysen in dieser Arbeit ausschließlich mit heterologen Sox-Proteinen aus Alc. vinosum erfolgten. Hierbei stellte sich heraus, dass die Aktivität des gesamten Systems durch eine Aktivierung von SoxYZ beeinflusst wird, welche durch Sulfidinkubation induziert werden kann. Hierbei kommt es zu einer Persulfurierung aber auch Konformationsänderung von SoxYZ. Die periplasmatische Schwefeltransferase SoxL besitzt einen deutlichen Einfluss auf die Funktion von SoxYZ und modifiziert die Aktivität des Sox Systems in vitro. Diese Schwefeltransferase zeigt zwar keine charakteristische Thiosulfat:Cyanid Schwefeltransferaseaktivität, war aber in der Lage nach Sulfidbehandlung zusätzlichen Schwefel aufzunehmen, was mittels des Thiol-reaktiven Reagenz 1,5-I-ADAENS nachgewiesen werden konnte. Auch ein Schwefeltransfer von SoxYZ zu SoxL konnte mit dieser Methode verifiziert werden, was die Vermutungen stützt, dass SoxL den Sulfanschwefel von SoxYZ zu den Schwefelkugeln transferieren könnte. Mittels Präzipitationsstudien konnte außerdem eine Interaktion zwischen SoxYZ und SoxL nachgewiesen werden, wobei es Hinweise darauf gibt, dass SoxL in der Lage sein könnte, SoxYZ strukturell zu aktivieren.