Abbildung und farbtonbasierte Analyse ausgedehnter neuronaler Strukturen

Abstract

Der Hippocampus ist eine Gehirnregion im mittleren Temporallappen, welcher für die Formung des expliziten Gedächtnisses zuständig ist. Lange Zeit galt der Dentatus Gyrus (DG), eine Region im Hippocampus, als “Eingang“ für Informationen von außerhalb des Hippocampus. Neuere Studien weisen jedoch darauf hin, dass auch die CA3-Region, welche an den DG angrenzt, diese Aufgabe übernehmen kann. <br /> Im Rahmen dieser Arbeit wurden deshalb Methoden entwickelt, um Projektionen aus der CA3-Region in den DG untersuchen zu können. Für die Abbildung der entsprechenden Hirnregionen wurde ein Lichtscheibenfluoreszenzmikroskop (LSFM) entworfen und aufgebaut, welches auf die Untersuchung besonders großer und fragiler Proben spezialisiert ist. Mithilfe der LSFM ist es möglich, große Regionen mosaikartig in relativ kurzer Zeit abzubilden, wobei die Bilder einen hohen Kontrast und ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis aufweisen. Zudem ermöglicht das entwickelte LSFM die simultane Aufnahme von zwei Farbkanälen, was bei der Abbildung polychromer Proben eine große Zeitersparnis bedeutet. Die zu untersuchenden Proben sind Hirnschnitte von Mäusen, welche mit der Methode der Expansionsmikroskopie (ExM) behandelt und somit vollständig transparent und zudem physisch vergrößert sind. Durch die Transparenz sind Absorption und Streuung des Anregungslichtes in der Probe minimiert. Gleichzeitig ist durch die physische Vergrößerung die effektive Auflösung erhöht, sodass große Regionen mit einer hohen Auflösung abgebildet werden können. <br /> Die Neuronen in den zu untersuchenden Hirnschnitten wurden vorab mit der Tetbow-Methode fluoreszenzmarkiert. Dabei handelt es sich um eine statistische Verteilung dreier Fluorophore in den Neuronen, welche in der Überlagerung einen für jedes Neuron individuellen Farbton ergeben. Die Abbildung dieser Neuronen geschieht teilweise simultan mit einer Anregung von drei Lasern bei passender Anregungswellenlänge. <br /> Zur Auswertung der Bilder wurde in einem zweiten Teil der Arbeit eine Analyse-Pipeline entwickelt. Diese hat zum Ziel, individuelle Neuronen in einem Bildstapel anhand ihres Farbtons zu segmentieren, d.h. von anderen Strukturen freizustellen. Dazu werden die Rohdaten zunächst gefiltert, um Rauschen zu reduzieren, die mosaikartigen Bildstapel zu einem großen Bildstapel zusammengefügt und die RGB-Bilder in den HSV-Farbraum konvertiert. Anhand des H-Kanals, welcher den Farbton codiert, und des V-Kanals, welcher die Intensität wiedergibt, werden, ausgehend von den Zellkörpern, die Neuronen mit einem modifizierten flood fill-Algorithmus segmentiert. Der Erfolg der Segmentierung wird abschließend mithilfe der berichtigten Transinformation, einer Größe aus der Informationstheorie, quantifiziert. Anwendung findet diese Analyse-Pipeline schließlich in der Segmentierung einzelner Neuronen in Bildstapeln, welche zuvor mit dem entwickelten LSFM aufgenommen wurden.