Biochemical characterization of the human Cyclin-dependent kinases Cdk7 and Cdk10

Abstract

Protein kinases comprise a large superfamily of enzymes regulating a plethora of cellular processes. Dysregulation of protein kinases, such as loss of activity, hyperactivity or mislocalisation, is often accompanied with severe malignancies. The family of Cyclin-dependent kinases (CDKs) has been first described for their regulation of the mitotic cell cycle. However, of the 21 CDK family members found in man only the CDKs 1, 2, 4, and 6 are directly involved in cell cycle regulation. Another subset regulates gene expression at the level of transcription and transcription associated processes, whereas several other CDKs have no established function yet. Common to all Cyclin-dependent kinases is the requirement of the association with a regulatory cyclin subunit for activation. In addition to cyclin binding, phosphorylation of the kinase within an activation segment, called T-loop, is required for kinase activation. <br /> Cdk7 forms a ternary complex with Cyclin H and the protein Mat1. Cdk7 is involved in both cell cycle regulation and transcription. Cdk7 phosphorylates the T-loop of the cell cycle CDKs 1, 2, 4, and 6 leading to their activation. Additionally, Cdk7 is involved in transcription initiation as it associates with the general transcription factor TFIIH. Within recent years, pharmacologic inhibition of Cdk7 has emerged as a promising therapeutic target in cancer treatment. Cdk7 has been studied for almost three decades, but nonetheless regulation of Cdk7 kinase activity at a molecular level is not understood in detail. In contrast to Cdk7, only very few studies address the functional role of Cdk10 to date. Concomitantly, the regulatory cyclin subunit of Cdk10, Cyclin M, has not been identified until 2013. In cancer, Cdk10 is mostly described as a negative regulator of cell cycle progression and reduced Cdk10 levels were found to confer tamoxifen resistance in breast cancer. In this thesis, the human cyclin-dependent kinases Cdk7 and Cdk10 in complex with their regulatory subunits have been analysed by biochemical and biophysical techniques. <br /> In contrast to other CDKs, Cdk7 is phosphorylated at two sites within its T-loop, Ser164 and Thr170. Of these two sites, Thr170 resembles the canonical activation residue which is conserved among CDKs. The second phosphorylation site at Ser164 has been implicated in stability and activity regulation of Cdk7 but no apparent function has been attributed to this phosphorylation mark so far. A focus of the first part of this thesis was to study the effect of Cdk7 Ser164 phosphorylation on kinase activity and complex formation using recombinant protein. By mutational analyses, in which Cdk7 Ser164 was replaced by a non-phosphorylatable alanine, it could be shown that phosphorylation of Cdk7 is required for full activity of the ternary Cdk7/CycH/Mat1 complex. Importantly, the Cdk7 S164E mutation, which was introduced in order to mimic the Cdk7 Ser164 phosphorylation, did not recapitulate the effect of Ser164 phosphorylation in wild type Cdk7 preparations. However, the effect of Ser164 phosphorylation within ternary complexes could be restored in the Cdk7 S164E mutant by truncation of the Cyclin H C-terminus to amino acid 291 (CycH 1-291). Surprisingly, the Cdk7 S164A mutant failed to bind the truncated CycH (1-291) protein in co-purification experiments. This result was unexpected as the Cyclin H C-terminus is supposed to be unstructured and does not contain any canonical feature for Cdk/Cyclin interaction. Together, these data suggest an inhibitory regulatory element residing in the C-terminus of Cyclin H which is reallocated upon Cdk7 Ser164 phosphorylation. <br /> Despite its discovery 25 years ago, only little is known about the Cyclin-dependent kinase 10 (Cdk10) and its cellular functions. In the second part of this thesis, human recombinant Cdk10/CycM from Sf9 insect cells was analysed for activity and substrate specificity. Moreover, new substrates of Cdk10/CycM were identified by mass spectrometry analyses. Expression of wild type Cdk10/CycM complexes in Sf9 cells resulted in active kinase complexes without special needs to activate the kinase recombinantly. Initial activity measurements in radioactive kinase assays using recombinant substrates revealed in vitro kinase activity towards the typical CDK substrates c-MYC and RNA polymerase II C-terminal domain (CTD). <br /> In order to identify new Cdk10 substrates by mass spectrometry, an in vitro chemical genetic screen was performed. To this end, the Cdk10 gatekeeper residue methionine 117 was mutated to glycine resulting in an analogue-sensitive Cdk10 M117G mutant. The Cdk10 M117G mutation enlarges the ATP binding pocket which allows Cdk10 to tolerate bulky ATP-analogues as substrates. Due to their size, these ATP-analogues are not used by native, cellular kinases which confers specificity of the labelling reaction to the mutant Cdk10 M117G/CycM complex. To discriminate and purify Cdk10 M117G/CycM phosphorylated proteins from other phosphoproteins in the lysate, ATP-gamma-S analogues were used which allows for the specific enrichment by a covalent capture and release protocol. Mass spectrometric identification of thio-phosphorylated proteins from cell lysates and nuclear extracts was performed in collaboration with Prof. Dr. Henning Urlaub at the Max Planck Institute for Biophysical Chemistry in Göttingen. In total, 66 putative Cdk10/CycM substrates were identified. Analysis of the biological function by GO-term analysis shows an enrichment of RNA regulatory and translation related proteins. Six of the putative substrates were selected and validated as Cdk10/CycM substrates in vitro using recombinant proteins in kinase activity measurements. <br /> In this thesis a new regulatory mechanism for Cdk7 activity regulation was discovered. Given the central role of Cdk7 in cell cycle and transcription regulation as well as its pharmacological relevance as a target in cancer, mechanisms that alter Cdk7 activity are of major importance to understand the physiological and pathological roles of Cdk7. Future studies shall be performed to address the regulation by Cdk7 Ser164 phosphorylation in vivo. In case of Cdk10, this study will facilitate future investigations by providing a protocol for the recombinant expression and purification of Cdk10/CycM complexes. Moreover, the thesis contains a rich dataset of Cdk10 substrates, which will help to elucidate the biological function of this kinase complex.

Die Familie der Proteinkinasen umfasst im Menschen 518 verschiedene Mitglieder welche eine Vielzahl zellulärer Prozesse und Signalwege regulieren. Fehlregulation von Kinasen wie beispielsweise Mutationen, die zu Verlust oder Hyperaktivität der enzymatischen Aktivität führen sind häufig mit Krankheiten assoziiert. Die Familie der Zyklin-abhängigen Kinasen (engl. Cyclin-dependent kinase, CDK) ist bekannt für die Regulation der zellulären Proliferation. Allerdings haben von den 21 CDKs, die im Menschen vorhanden sind nur vier, nämlich Cdk1, 2, 4 und 6 einen direkten Einfluss auf die Regulation des Zellzyklus. Andere Vertreter dieser Gruppe regulieren die Transkription der DNA. Gemeinsam ist diesen Kinasen, dass sie erst durch Bindung einer regulatorischen Untereinheit, dem Zyklin, in eine Aktive Konformation überführt werden. Zudem ist für die Aktivität eine Phosphorylierung im Aktivierungssegment, dem T-loop, nötig. <br /> In Zellen assoziiert die Kinase Cdk7 mit ihrer regulatorischen Untereinheit Zyklin H (engl. Cyclin H, CycH) sowie einem weiteren, stabilisierend wirkendem Protein, Mat1. Innerhalb der CDKs kommt Cdk7 eine Sonderstellung zu, da es einerseits die Zellzyklus CDKs 1, 2, 4 und 6 durch Phosphorylierung im T-loop aktiviert und andererseits als Teil des allgemeinen Transkriptionsfaktors TFIIH unmittelbar an der Regulation der Transkription beteiligt ist. Zudem kommt Cdk7 eine in den letzten Jahren wachsende Bedeutung für die Therapie verschiedener Krebserkrankungen zu. Trotz des großen Interesses sind die molekularen Grundlagen für die Regulation von Cdk7 jedoch noch immer nur unzureichend verstanden. Im Gegensatz zu Cdk7, welches in den vergangenen Jahrzehnten Gegenstand intensiver Forschung war ist die Zyklin-abhängige Kinase 10 (Cdk10) bisher kaum erforscht. Die identifizierung der regulatorischen Zyklin-Untereinheit erfolgte zudem erst 2013. In Krebsmodellen fungiert Cdk10 meist als ein negativer Regulator des Zellzyklus und verminderte Cdk10 Expressionslevel wurden als mögliche Ursache für Tamoxifenresistenz bei Brustkrebs identifiziert. In dieser Doktorarbeit wurden die humanen Zyklin-abhängigen Kinasen Cdk7 und Cdk10, sowie deren regulatorische Untereinheiten heterolog exprimiert und mittels biochemischer und biophysikalischer Methoden untersucht. <br /> Im Gegensatz zu anderen CDKs wird Cdk7 an zwei Stellen, Ser164 und Thr170, innerhalb seines Aktivierungssegments phosphoryliert. Dabei handelt es sich bei Thr170 um die kanonische Phosphorylierungsstelle für die Aktivierung der Kinase, welche auch in den anderen CDKs konserviert ist. Der zusätzlichen Phosphorylierung von Cdk7 an Ser164 wurde eine Rolle für die Stabilität, sowie die Aktivität der Kinase zugeschrieben. Allerdings konnte in bisherigen Studien keine Eindeutige molekulare Funktion dieser post-translationalen Modifikation gefunden werden. Ein Fokus dieser Arbeit war der Einfluss der Cdk7 Ser164 Phosphorylierung auf die Kinaseaktivität, sowie die Komplexbildung von Cdk7 mit seinen regulatorischen Untereinheiten. <br /> Cdk7 Serin164 wurde dazu durch die Aminosäure Alanin, welche nicht phosphoryliert werden kann oder die Aminosäure Glutamat, welche eine konstitutive Phosphorylierung simuliert, ersetzt. Beide Punktmutanten wurden dann mit an Ser164/Thr170 doppelt phosphoryliertem wildtyp Cdk7 Präparationen verglichen. Es zeigte sich, dass die zusätzliche Phosphorylierung an Cdk7 Ser164 notwendig für die volle Aktivität von heterotrimeren Cdk7/CycH/Mat1Komplexen ist. Auf die Aktivität heterodimerer Cdk7/CycH Komplexe hatte die phosphorylierung hingegen keinen Einfluss. Die Ser164 Mutationen hatten keinen Einfluss auf die Bindungsaffinität des Cdk7/CycH Komplexes an Mat1. Interessanterweise, ließ sich die Phosphorylierung von Cdk7 Ser164 nicht durch die Punktmutation von Serin164 zu Glutamat adäquat imitieren. Allerdings führte eine C-terminale Trunkierung von Cyclin H an Aminosäure 291 (CycH 1-291) zu einer gesteigerten Aktivität in trimeren Cdk7S164E/CycH (1-291)/Mat1 Komplexen, die mit der von wildtyp Cdk7 vergleichbar war. Überaschenderweise führte die Entfernung des C-Terminus von Cyclin H zu einem kompletten Verlust der Bindung an die Cdk7 S164A Mutante. Dies ist insofern überraschend als das sich im C-terminale Abschnitt von Cyclin H keine Elemente befinden, die für die Cdk/Zyklin Interaktion beschrieben sind. Zusammen weisen diese Daten darauf hin, dass der C-terminus von Cyclin H, in Verbindung mit Cdk7 Ser164 Phosphorylierung, eine unerwartete Rolle bei der Cdk7/CycH Bindung und der Aktivitätsregulation von ternären Cdk7/CycH/Mat1 Komplexen einnimmt. <br /> Trotz der ersten Beschreibung von Cdk10 vor bereits 25 Jahren ist wenig über die zelluläre Funktion der Zyklin-abhängigen Kinase Cdk10 bekannt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde humane recombinant hergestellte Cdk10/CycM Komplexe auf ihre Aktivität und Substratspezifität hin untersucht. Zudem wurden neue Substrate von Cdk10/CycM mittels Massenspektrometrie. <br /> Initiale Aktivitätsmessungen mit wildtyp Cdk10/CycM zeigten eine in vitro Aktivität gegenüber der RNA polymerase II C-terminalen Domäne, sowie des Transkriptionfaktors c-MYC. Bisher sind lediglich die Proteine ETS-2, sowie PKN2 als Cdk10 Substrate beschrieben. Zur Erweiterung des Substratspektrums wurden in dieser Arbeit neue Cdk10 Substrate in vitro mittels Massenspektrometrie bestimmt. Dazu wurde per Punktmutation von Cdk10 Methionin zu Glycin eine Analog-sensitive Cdk10/CycM Mutante generiert. Die Punktmutation vergrößert die ATP Bindungstasche und erlaubt so die Verwendung von N6-modifizierten ATP-Analogen, welche nicht von nativen Kinasen verwendet werden können. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von N6-modifiziertem ATP-gamma-S zu einer bio-orthogonalen thio-phosphorylierung, die die spätere Diskriminierung und Anreicherung der Cdk10 M117G/CycM Substrate ermöglicht. In Aktivitätstests konnte gezeigt werden, dass die Punktmutation Cdk10 M117G nicht zu einem Verlust der Kinaseaktivität führt. Zudem konnte die sensitivität gegenüber N6-modifizierter ATP-Analoga bestätigt werden. Die Anreicherung der thio-phosphorylierten Substrate, sowie die Massenspektrometrische identifizierung etwaiger Cdk10/CycM substrate erfolgte in Kollaboration mit Prof. Dr. Henning Urlaub vom Max Planck Institut für Biophysikalische Chemie in Göttingen. Insgesamt konnten 66 neue Cdk10/CycM Substrate identifiziert werden. Die Analyse der biologischen Funktion mittels GO-term zeigte eine Anreicherung für RNA modifizierende und translatorische Prozesse. <br /> In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung von Cdk7 an Ser164 für die volle Aktivität des trimeren Cdk7/CycH/Mat1 Komplexes notwendig ist. In Anbetracht der zentralen Rolle von Cdk7 für Zellzyklus und Transkription sollten zukünftige Studien den phosphorylierungsstatus von Cdk7 in ihre Analyse einbeziehen. Im Falle von Cdk10/CycM liefert diese Arbeit erste Einblicke in das Substratspektrum dieser Kinase, sowie in die damit verbundenen zellulären Prozesse. Zudem ermöglicht das entwickelte Protokoll für die rekombinante Darstellung des Cdk10/CycM Komplexes eine wichtige Basis für weitere Studien.