Analyse der intranukleären Dynamik und des Exports der ribosomalen 60S-Untereinheit

Abstract

Die Proteinbiosynthese wird von Ribosomen - großen molekularen Maschinen - durchgeführt, die aus zahlreichen verschiedenen Proteinen und einem ribosomalen RNA-Rückgrat bestehen. Die Biogenese der ribosomalen Untereinheiten von Säugetieren beginnt im Nukleolus mit dem 90S-Vorläuferpartikel, das sukzessive in die prä-40S- und prä-60S-Untereinheiten gespalten wird. In weiteren Prozessierungsschritten werden die Untereinheiten mit Exportrezeptoren bela-den, was ihre Durchquerung der Kernporenkomplexe ins Zytoplasma ermöglicht. Hier erfolgt die Freisetzung der Exportfaktoren und beide Untereinheiten können zusammen das finale Ribosom bilden. Die ribosomale Biogenese ist bisher mit biochemischen, genetischen und elektronenmikroskopi-schen Methoden sehr detailliert untersucht worden, jedoch stellt die Bestimmung der in vivo Kinetik in lebenden Zellen immer noch eine große Herausforderung dar. <br /> In dieser Arbeit wurde die Export-Kinetik der großen ribosomalen Untereinheiten ("prä-60S-Partikel") durch einzelne Kernporenkomplexe in lebenden menschlichen Zellen bestimmt. Zur Untersuchung dieses Prozesses in vivo, wurde eine stabile Zelllinie erstellt, welche HaloTag-markiertes eIF6 und GFP-gebundenes NTF2 ko-exprimiert, zur simultanen Beobachtung der großen 60S-Untereinheit (eIF6) und der Kernporen (NTF2) . Durch eine Kombination von hoch-auflösender konfokaler Mikroskopie mit einer schnellen und sensitiven Einzelmolekülverfolgung in einem selbstentwickelten Mikroskop-Aufbau konnte die Dynamik einzelner prä-60S-Partikel während der Interaktion mit und des Exports durch einzelne Kernporen sichtbar gemacht wer-den. Auf diese Weise ergaben sich bisher noch nie gezeigte Einblicke in die Kinetik und Dynamik dieses zellulären Schlüsselprozesses. <br /> In dieser Studie zeigte sich, dass für Export-Ereignisse die prä-60S-Partikel vor allem im Zentrum der Kernpore akkumulieren, während nicht-erfolgreiche Exporte innerhalb des nukleären Korbs abbrechen. Der Exportvorgang erfolgt mit nur einem geschwindigkeitsbestimmendem Schritt und einer Translokationszeit von ~24 ms. Nur 1/3 der Exportvorgänge waren erfolg-reich. Unter Berücksichtigung der molekularen Masse der prä-60S-Partikel folgte außerdem, dass der Massenfluss durch eine einzelne Kernpore in vivo bis zu ~125 MDa/s betragen kann.

Protein biosynthesis is carried out by ribosomes – large molecular machines – consisting of numerous different proteins and a ribosomal RNA backbone. The biogenesis of mammalian ribosomal subunits begins in the nucleolus with the 90S precursor particle, which is subsequently split into the pre‐40S and pre‐60S subunits. During further processing steps the subunits are loaded with export receptors, which allows for their passage through the nuclear pore complexes into the cytoplasm. Here the export factors are released and both subunits can form the final ribosome. <br /> Ribosomal biogenesis has been studied in great detail by biochemical, genetic and electron microscopic approaches, however, determining in vivo kinetics in living cells is still a major challenge. <br /> In this work, the export kinetics of large ribosomal subunits (“pre-60S particle”) through single nuclear pore complexes in living human cells was analysed. To study this process in vivo, a stable cell line co-expressing HaloTag-tagged eIF6 and GFP-fused NTF2 was established to simultaneously label ribosomal 60S subunits (eIF6) and NPCs (NTF2). By combining high-resolution confocal microscopy with rapid and sensitive single-molecule tracking in a highly customized microscopic setup, the dynamics of single pre-60S particles during interaction with and export through single nuclear pores could be visualized. In this way, previously unprecedented insights into the kinetics and dynamics of this key cellular process emerged. <br /> In this study, it was shown that for export events, pre-60S particles accumulate primarily in the centre of the nuclear pore, while unsuccessful exports terminate within the nuclear basket. The export event occurs with only one rate-determining step and a translocation time of ~24 milliseconds. Only about 1/3 of the export events were successful. Considering the molecular mass of the pre-60S particles, it could be concluded that the mass flow through a single nuclear pore in vivo can be as high as ~125 MDa/s.