Funktionelle Untersuchungen des ABC-Transporters ABCG2

Abstract

Das Phänomen der Multidrug Resistance (MDR) stellt ein bedeutsames Problem bei der Behandlung von Tumoren mit Chemotherapeutika dar. Die ABC-Transporter ABCB1, ABCC1 und ABCG2 sind an der Entstehung der MDR beteiligt. ABC-Transporter benötigen Energie, die sie aus der Hydrolyse von Adenosintriphosphat zu Adenosindiphosphat und Phosphat gewinnen. Sie kommen ubiquitär in Organismen vor. In Tumoren können multiple Transporter überexprimiert vorliegen, die zahlreiche SNPs aufweisen können. Durch Fortschritte in diagnostischen Methoden und der personalisierten Medizin ergeben sich für die Behandlung der MDR neue Möglichkeiten. Grundlage für die therapeutische Anwendung bildet das Verständnis der mechanistischen Vorgänge. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Methoden etabliert und genutzt, um ein weiterführendes Verständnis zur Funktionsweise von ABCG2 zu gewinnen. Ein zentrales Thema stellte dabei die Charakterisierung von Verbindungen bezüglich ihres Effektes auf die ATPase Aktivität von ABCG2 dar. Mit Hilfe des Vanadat-sensitiven ATPase Assays und den fluoreszenzbasierten funktionellen Assays, Hoechst 33342 Assay und Pheophorbid A Assay, wurden Vertreter aus verschiedenen Substanzbibliotheken hinsichtlich ihrer Effekte auf die ATPase Aktivität von ABCG2 untersucht. Zunächst wurde eine Reihe von Tariquidar-Analoga, HM30181-Analoga und Elacridar-Analoga charakterisiert. Als eine entscheidende strukturelle Modifikation stellte sich dabei die Anwesenheit oder Abwesenheit des Tetrahydroisochinolinrestes heraus. Kryo-EM-Strukturen zeigen, dass Inhibitoren und Aktivatoren der ATPase Aktivität in der gleichen Bindungsstellte von ABCG2 binden, aber durch unterschiedliche Interaktionen mit den transmembranären Helices verschiedene Auswirkungen auf die Funktion von ABCG2 haben. Basierend auf veröffentlichten Kryo-EM-Strukturen mit dem Tariquidar-Analogon MB136 (PDB 6FEQ) wurde ein Pharmakophormodell erstellt. Die im Rahmen dieser Arbeit für eine Auswahl der getesteten analogen ATPase-Inhibitoren durchgeführte Konformationssuche ergab, dass diese entweder eine gleiche oder eine ähnliche, in Teilen deckungsgleiche Konformation, in der Bindungstasche von ACBG2 einnehmen können. Kombinationsexperimente im Vanadat-sensitiven ATPase Assay legen ebenfalls nahe, dass die Bindung von Ko143 und der Tariquidar-Analoga mit Tetrahydroisochinolinrest in der Bindungstasche von ABCG2 unterschiedlich ist. Diese Beobachtung wird durch die Ergebnisse der Kryo-EM-Strukturen bestätigt.<br /> Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Charakterisierung von 2-Arylamino-1H-benzimidazolen. Es konnte gezeigt werden, dass geringe strukturelle Modifikationen zu drastischen Veränderungen des Einflusses auf die ATPase Aktivität führen.<br /> Unter Verwendung der neu etablierten Methode des Vanadat-sensitiven ATPase Assays wurden Kombinationsexperimente mit Hoechst 33342 und Aktivatoren der ATPase Aktivität mit verschiedener Grundstruktur durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Verbindungen unabhängig von ihrer Grundstruktur in der Lage sind, die inhibierende Wirkung von Hoechst 33342 auf die ATPase Aktivität zu überwinden. Diese Beobachtung könnte der Hemmung des Hoechst 33342 Transports im funktionellen Hoechst 33342 Assay entsprechen.