Aktivierung der Mikrotubuli - Nukleationsfunktion des γ-Tubulin-Ring Komplexes

Abstract

Mikrotubuli (MT) sind ein wesentlicher Bestandteil des Cytoskelettes und ihre Struktur und Funktion in allen Eukaryoten hoch konserviert. Bei der Zellteilung sind MT essentiell für die Segregation der Chromatiden auf die beiden Tochterzellen. Für die Segregation werden MT von den beiden Polen der Mitosespindel ausgehend polymerisiert. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Assemblierung von MT ist deren Nukleation. Der MT Nukleationsursprung wird aus der Matrize von 14 γ-Tubulinen mit verschiedenen assoziierenden Proteinen, dem γ-Tubulin Ring Komplex (γ-TuRC), gebildet. Gereinigt aus Xenopus Eiextrakt (XEE) zeigt der γ-TuRC in der Kryo-Elektronenmikroskopie die erwartete helikale Struktur einer Matrize, die aber Abweichungen zur modellierten Struktur eines optimalen Nukleators aufweist. Für eine effiziente Nukleation bedarf es einer Konformationsänderung, die wahrscheinlich über einen Aktivator induziert wird. Voraussetzung dafür ist, dass sowohl der γ-TuRC als auch der Aktivator in räumlicher Nähe zueinanderstehen bzw. kolokalisiert sind. Gleichzeitig müssen die beiden Komponenten zusammen eine messbare Erhöhung der Nukleationseffizienz leisten. In der Literatur werden Kandidaten für einen Aktivator bereits teilweise charakterisiert und diskutiert. Um weitere mögliche Kandidaten am γ-TuRC zu detektieren wurden verschiedene Tandem MS/MS durchgeführt.<br /> Nach Auswertung aller Daten wurden in dieser Arbeit vier Kandidaten als mögliche Aktivatoren analysiert. Die zentrosomale Lokalisation der Nukleosid Diphosphat Kinase 7 (Nme7) war bekannt und bringt durch die Kinase bzw. Histidinkinaseaktivität einen möglichen Wirkmechanismus mit. Hier konnte gezeigt werden, dass das Protein als möglicher Aktivator des γ-TuRC in Frage kommt, jedoch in der eigentlichen Funktion zu schwach ist. Das maternal Effekt lethal Protein 28 (MEL-28) ist in der Interphase ein Bestandteil des Kernporenkomplexes (NPC) und bei der Zellteilung an den Kinetochoren lokalisiert. Gleichzeitig sind auch Proteine des NPC an den Spindelpolen lokalisiert. Eine Interaktion mit dem γ-TuRC ist vorstellbar, konnte im Funktionsversuch allerdings nicht hinreichend belegt werden. Erstmalig sind die Transportproteine 23 und 24 (Sec23/Sec24) als Bestandteile der COPII Vesikel in der Interphase am γ-TuRC detektiert worden. Es kommt zwar zu einer Veränderung der Aktivität am γ-TuRC, diese ist aber nicht stark genug um ausreichend MT Nukleation für die Aufteilung der Chromatiden zu gewährleisten. Als bester Kandidat wird die Cyclin abhängige Kinase 5 regulatorische Untereinheit assoziierendes Protein 2 (Cdk5rap2) identifiziert. Bei den späteren ex vivo und in vitro Analysen zeigte sich in Anwesenheit des N-terminalen Endes von Cdk5rap2 eine erhöhte Ausbildung von MT. Das genannte Fragment beinhaltet eine funktionale Domäne, die in direktem Kontakt mit dem γ-TuRC steht. Gibt man in das XEE oder gereinigte Tubulin ausschließlich die CM1 Domäne, so steigert die Anzahl an MT. Unter dem Einfluss einer mutierten CM1 Domäne reduziert sich die Anzahl der MT-Strukturen. Schlussendlich kann man daher sagen, dass Cdk5rap2 einen direkten Einfluss auf den γ-TuRC hat. Es bleibt die Frage offen, ob weitere Modulatoren die Reaktion sowohl aktiv wie auch passiv beeinflussen können.