Gating of the Hv1 proton channel

Abstract

Hv1 is a voltage-gated proton channel, which is involved in the regulation of the intracellular pH (pHi) in immune cells. Among the voltage-gated ion channels, Hv1 is unique because it lacks a classical pore domain and its voltage-sensor domain (VSD) also forms the pore. Thus, its pore structure, as well as the opening and closing of the pore (gating), differs from classical voltage-gated ion channels. Molecular mechanisms underlying gating, in particular the coupling of voltage sensing and pore opening, are not well understood. In this thesis I used targeted crosslinking of engineered cysteine side chains to measure interactions, distances, and distance changes between amino-acid side chains. 1,1-methanediyl bismethanethiosulfonate (MTS-1-MTS) was suitable for crosslinking specific cysteine side chains in transmembrane segments S1 (151C) and S4 (262C) in the closed state of the channel, which showed that the cysteine side chains approached 3-4 Å during gating. By combining crosslinking with patch-clamp fluorometry (PCF), I was able to show that crosslinking blocks the S1 gating movement. In further experiments, this combinatorial approach will contribute to our understanding of structure-function relationships in Hv1. <br> In Hv1, gating is controlled not only by membrane voltage but also by the difference between extracellular and intracellular pH (&#916;pH), being coupled such that Hv1 opens only when the electrochemical proton gradient is outwardly directed. The coupling between voltage- and &#916;pH-sensing is not understood at the molecular level. Here, I investigated the underlying molecular mechanism in PCF experiments by altering the &#916;pH by means of perfusion or light- controlled proton release. I could show that a &#916;pH change can induce conformational changes of S4 but not of S1. The results are consistent with the idea that S4 can sense both voltage and &#916;pH. Furthermore, I could show that S4 of another voltage-sensitive protein (voltage-gated phosphatase, VSP) is not sensitive to &#916;pH, indicating Hv1-specific structure-function relationships for &#916;pH sensing.

Hv1 ist ein spannungsgesteuerter protonenselektiver Ionenkanal, der unter anderem in Immunzellen an der Regulation des intrazellulären pH (pHi) beteiligt ist. Unter den spannungsgesteuerten Ionenkanälen ist Hv1 einzigartig, da der Kanal keine klassische Porendomäne aufweist und seine Spannungssensordomäne (VSD) auch die Pore bildet. Damit unterscheidet sich seine Porenstruktur, sowie das Öffnen und Schließen der Pore (Gating) von klassischen, spannungsgesteuerten Ionenkanälen. Molekulare Mechanismen, die dem Gating zugrunde liegen, insbesondere die Kopplung von Spannungsdetektion und Porenöffnung, sind nicht gut verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit benutzte ich gezieltes Quervernetzen (Crosslinking) von künstlich eingeführten Cystein-Seitenketten, um Interaktionen sowie Abstände und Abstandsänderungen zwischen einzelnen Aminosäureseitenketten zu messen. 1,1-Methanediyl Bismethanethiosulfonate (MTS-1-MTS) eignete sich zum Crosslinking von bestimmten Seitenketten in Transmembransegmenten S1 (151C) und S4 (262C) im geschlossenen Zustand des Kanals, was zeigte, dass sich die Cystein-Seitenketten während des Gatings auf 3-4 Å annähern. Durch Kombination von Crosslinking mit Patch-Clamp-Fluorometrie (PCF) konnte ich zeigen, dass die Quervernetzung die S1-Gatingbewegung blockiert. Weitere Experimente mit diesem kombinatorischen Ansatz werden zu unserem Verständnis von Struktur-Funktionsbeziehungen in Hv1 beitragen. <br> Das Gating von Hv1 wird neben der Membranspannung auch durch die Differenz zwischen extrazellulärem und intrazellulärem pH (&#916;pH) gesteuert. Dabei sind &#916;pH- und Spannungssteuerung derart gekoppelt, dass Hv1 nur öffnet, wenn der elektrochemische Protonengradient nach außen gerichtet ist. &#916;pH-Detektion, sowie die Kopplung von dpH- und Spannungsdetektion sind auf molekularer Ebene nicht verstanden. Hier untersuchte ich den zugrunde liegenden Mechanismus in PCF-Experimenten durch &#916;pH-Änderungen mittels Perfusion oder lichtgesteuerter Protonenfreisetzung. &#916;pH-Änderungen führten zu Konformationsänderungen von S4, nicht jedoch von S1. Die Ergebnisse erlauben die Schlussfolgerung, dass S4 neben der Membranspannung auch &#916;pH detektiert. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass S4 eines anderen spannungssensitiven Proteins (spannungsgesteuerte Phosphatase, VSP) nicht &#916;pH gesteuert ist, was auf Hv1-spezifische Struktur-Funktionsbeziehungen zur Detektion von &#916;pH hindeutet.