Die Rolle der RNasen T2 und 2 bei der Aktivierung des Toll-like Rezeptors 8

Abstract

Anders als in Mäusen ist die Aktivierung des humanen Toll-like Rezeptor 8 (TLR 8) als Induktor einer TH-1-Helferzellantwort via monozytärer IL-12p70-Sekretion von entscheidender Bedeutung für die Immunantwort auf intrazelluläre Pathogene. Wie in einer früheren Studie mittels Kristallstruktur gezeigt, beinhaltet TLR 8 zwei Bindungstaschen: einerseits für einzelne Uridine, andererseits für Di- und Trinukleotide. Dies führte zu der Annahme, dass die Aktivierung von TLR 8 nicht durch native einzel- oder doppelsträngige RNA erfolgt, sondern durch Degradationsprodukte ebendieser RNA. Der Mechanismus der Bereitstellung ebendieser Degradationsprodukte und die daran beteiligten, etwaigen RNasen blieben jedoch lange unbekannt. <br /> In dieser Arbeit konnten RNase T2 und RNase 2 als Hauptakteure endolysosomaler Degradation identifziert werden. Für die biochemische Charakterisierung der RNasen erfolgte die Synthese und Aufreinigung rekombinanter RNase T2 und 2. Die Abbauprodukte wurden zur Charakterisierung zusätzlich massenspektrometrischen Analysen unterzogen. Zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung für die Aktivierung von TLR 8 wurden RNase T2^-/- und RNase 2^-/- Zellen (THP-1, BLaER1) generiert und schließlich eine TLR 8-Aktivierung inklusive konsekutiver Immunantwort mittels endolysosomaler Transfektion synthethischer und bakterieller RNA bzw. lebender Pathogene (Bakterien und <i>P. falciparum</i>) provoziert. Funktionelle Analysen erfolgten zusätzlich in primären, mononuklearen Zellen (PBMC) aus dem Blut eines Patienten mit kongenitaler RNase T2 <i>loss-of-function</i>-Mutation in Zusammenarbeit mit der Neuropädiatrie der Universitätsmedizin Göttingen. Es konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von RNase T2 und RNase 2 sowie die durch sie vermittelte Ribonukleolyse eine notwendige Instanz für die Aktivierung von TLR 8 darstellt. Bei Fehlen beider RNasen konnte eine TLR 8-Aktivierung durch RNA nicht mehr beobachtet werden, wohl aber durch bereits bekannte und beschriebene, niedermolekulare Agonisten (sog. <i>small molecules</i>), die keiner vorherigen Degradation bedürfen. In der biochemischen Charakterisierung sowie durch die erfolgten massenspektrometrischen Analysen konnte ein konzertiertes Schneideverhalten der beiden RNasen beobachtet werden: während RNase T2 präferentiell vor einem Uridin schneidet, erfolgt die Ribonukleolyse durch RNase 2 dahinter. So erfolgt eine koordinierte Freisetzung von sowohl einzelnen Uridinen als auch von Di- und Trinukleotiden. <br /> Die dieser Dissertation zugrundeliegende Studie weist nach, dass die Aktivierung von TLR8 durch Bakterien, <i>Plasmodium falciparum</i>-infizierte Erythrozyten, bakterielle RNA sowie auch durch synthetische Oligoribonukleotide in allen Fällen eine durch RNase T2 und 2 vermittelte, vorherige Degradation voraussetzt. So wird sowohl ein detailliertes Verständnis der TLR 8-Aktivierung als auch eine zielgerichtete Entwicklung synthetischer TLR 8-Agonisten, auch im Rahmen therapeutischer Zielsetzungen, ermöglicht wird.

Human toll-like receptor 8 (TLR8) activation induces a potent T helper-1 (Th1) cell response critical for defense against intracellular pathogens, including protozoa. The receptor harbors two distinct binding sites, uridine and di- and/or trinucleotides, but the RNases upstream of TLR8 remain poorly characterized. We identified two endolysosomal endoribonucleases, RNase T2 and RNase 2, that act synergistically to release uridine from oligoribonucleotides. RNase T2 cleaves preferentially before, and RNase 2 after, uridines. Live bacteria, P. falciparum-infected red blood cells, purified pathogen RNA, and synthetic oligoribonucleotides all required RNase 2 and T2 processing to activate TLR8. Uridine supplementation restored RNA recognition in RNASE2^-/- or RNASET2^-/- but not RNASE2^-/- RNASET2^-/- cells. Primary immune cells from RNase T2-hypomorphic patients lacked a response to bacterial RNA but responded robustly to small-molecule TLR8 ligands. Our data identify an essential function of RNase T2 and RNase 2 upstream of TLR8 and provide insight into TLR8 activation.