Einfluss der zellspezifischen Deletion des miR-17~92-Clusters auf die Entwicklung des Kleinhirns

Abstract

Seit der Entdeckung der ersten micro-Ribonukleinsäure (miRNA/miR) wurde intensiv an der Funktion von miRNAs bei der Entwicklung des Kleinhirns geforscht. Dennoch sind die Mechanismen, über die miRNAs die beteiligten Signalwege beeinflussen, noch weitgehend unverstanden. Das zentrale Ziel der vorliegenden Arbeit war die Evaluation der Bedeutung des miR-17~92-Clusters für die Entwicklung des Kleinhirns und für die Körnerzellmorphologie. Dazu wurden zwei Zell-spezifische Knockout-(cKO) -Mauslinien mit einer Deletion des miR-17~92-Clusters in Körnerzellen (KcKO) oder Purkinjezellen (PcKO) des Kleinhirns analysiert. <br /> Die miR-17~92-Cluster-Expression im Kleinhirn war in den juvenilen KcKO-Tieren im Vergleich zu den Wildtyp-(WT)-Tieren signifikant reduziert; dieser Unterschied war bei adulten Tieren weniger deutlich ausgeprägt. Auch zeigten nur die posterioren Kleinhirnbereiche von juvenilen, nicht aber adulten Tieren beider Genotypen eine höhere miR-17~92-Cluster-Expression als die anterioren Kleinhirnbereiche. Eine vollständige miR-17~92-Cluster-Deletion in KcKO-Kleinhirnen war nicht zu erwarten, da auch andere Zelltypen das Cluster exprimieren. <br /> KcKO- und PcKO-Mäuse zeigten eine mit Wildtyp-(WT)-Mäusen vergleichbare Gewichtsentwicklung und identisches Verhalten. Bei KcKO-Mäusen, nicht aber bei PcKO-Mäusen führte die Deletion des miR-17~92-Clusters zu Abweichungen bei der Kleinhirnentwicklung. Zu den Unterschieden gehörten ein verringertes Kleinhirngewicht und ein reduzierter Kleinhirnperimeter. Um diese Veränderungen standardisiert erfassen zu können, wurde ein Verfahren entwickelt, mit dessen Hilfe die Morphometrie einzelner Lobuli und Fissuren quantitativ analysiert werden konnte. Hier zeigte sich, dass die Entwicklungsdefizite überwiegend die anterioren Lobuli des Kleinhirns bei weitgehend normaler posteriorer Lobulierung betrafen. Der Unterschied zwischen den KcKO- und WT-Kleinhirnen verstärkte sich mit zunehmendem Alter der Tiere. <br /> Zur Analyse des Einflusses der miR-17~92-Cluster-Defizienz auf die Purkinjezellmorphologie in PcKO-Mäusen bzw. auf die Körnerzellmorphologie in KcKO-Mäusen wurde eine modifizierte Golgi-Färbungsmethode entwickelt, die eine detaillierte Auswertung einzelner Zellen im Kleinhirnschnitt erlaubte. Die Dendritenbäume von juvenilen PcKO-Purkinjezellen wiesen eine geringere Anzahl an Verzweigungen auf und schienen im Vergleich zu den WT-Purkinjezellen in ihrer Entwicklung rückständig zu sein. Dieser Unterschied zwischen juvenilen PcKO- und WT-Purkinjezellen kann, aufgrund entwicklungsbedingt variierender Differenzierungsgraden der Dendritenbäumen nicht eindeutig auf die fehlenden Funktionen des miR-17~92-Clusters in den PcKO-Purkinjezellen zurückgeführt werden. Darüber hinaus konnte in adulten PcKO-Tieren keine abweichende Purkinjezellschichtentwicklung beobachtet werden. <br /> KcKO-Körnerzellen dagegen wiesen – bei einer großen individuellen Schwankungsbreite – vergrößerte Somaflächen und verkürzte Dendriten auf. Unreife KcKO-Körnerzellen der externen Körnerzellschicht (EGL) zeigten zudem eine erhöhte Anzahl an proliferierenden und apoptotischer Zellen. Die Anzahl an apoptotischer Zellen war sowohl in der EGL als auch in der IGL erhöht. Ein Zusammenhang zwischen einer erhöhten Apoptose von Körnerzellen und der ubiquitären veränderten KcKO-Körnerzellmorphologie ist anzunehmen. <br /> Migrationsanalysen zeigten für die KcKO- im Vergleich zu WT-Körnervorläuferzellen aus den anterioren Lobuli eine erhöhte Wandergeschwindigkeit. Möglicherweise sind die reduzierten Kleinhirnperimeter mit anterioren Lobulierungsdefekten daher auf ein veränderte Migrationsmuster anteriorer KcKO-Körnerzellen zurückzuführen. Migrationsanalysen von KcKO Körnerzellen aus allen Lobuli zusammen ergaben jedoch auch eine erhöhte Migrationsgeschwindigkeit der KcKO Körnerzellvorläuferzellen. Ein Grund dafür könnte eine veränderte Aktin-Polymerisation in den KcKO Körnerzellen sein. Eine Datenbank-gestützte Zielgenanalyse für das miR-17~92-Cluster im Kleinhirn wies zudem auf einen Einfluss des miR-Clusters auf verschiedene grundlegende Signalwege in der Kommunikation zwischen den Zellen über den Transforming growth factor beta (TGF-ß) und den Sonic-hedgehog (Shh) Signalweg und innerhalb der Zelle über den mechanistic target of Rapamycin (mTOR) Signalweg hin. <br /> Zusammenfassend bietet die vorliegende Arbeit neue Einblicke in die Funktion der miRNAs des miR-17~92-Clusters im Rahmen der Entwicklung von Körnerzellen und belegt einen bisher unbekannten Mechanismus der differentiellen Regulierung der Entwicklung in den anterioren und posterioren Bereichen des Kleinhirns.