Charakterisierung des neuartigen mikrobiellen sHdr-Schwefeloxidationssystems
Charakterisierung des neuartigen mikrobiellen sHdr-Schwefeloxidationssystems
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DissertationDate of Exam
17.05.2022Date of Publication
15.07.2022Advisor
Dahl, ChristianeCo-Referee
Deppenmeier, UweMetadata
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Abstract
Viele Archaeen und Bakterien von ökologischer Relevanz für den globalen Schwefelkreislauf enthalten ein neuartiges Schwefeloxidationssystem (sHdr), das Ähnlichkeiten zur Heterodisulfid-Reduktase aus methanogenen Archaeen ohne Cytochrome aufweist (mHdr).
In dieser Arbeit wurde ein erster Schritt zur biochemischen Charakterisierung des sHdr-Systems unternommen, indem die Untereinheit sHdrA aus Hyphomicrobium denitrificans kristallisiert und ihre Cofaktoren biophysikalisch untersucht wurden. sHdrA besitzt eine ähnliche Struktur wie die Thioredoxinreduktase-Domäne aus mHdrA. Diese Domäne bindet im mHdr-Komplex das bifurkierende FAD. Die Kristallstruktur von sHdrA zeigte, dass dieses Protein als Homodimer vorliegt und je Monomer ein [4Fe-4S]-Cluster und ein FAD bindet. Eine durch Elektronenspinresonanz—Spektroskopie verfolgte Redoxtitration ergab ein Redoxpotential zwischen -203 und -188 mV für das [4Fe-4S]-Cluster. Für die Redoxpaare des FAD-Cofaktors wurden in einer Redoxtitration Werte zwischen -174 und -156 mV für das Redoxpaar Hydrochinon/Semichinon und ein Redoxpotential zwischen -81 mV und -19 mV für das Redoxpaar Semichinon/Flavochinon gemessen. Daraus resultiert ein inverser Elektronenfluss in sHdrA im Vergleich zu mHdrA. Die Beobachtung eines stabilen Semichinons in sHdrA, was durch die unterschiedliche Polarität der FAD-koordinierenden Aminosäuren im Vergleich zu mHdrA erklärt werden kann, spricht gegen eine bifurkierende Eigenschaft von sHdrA. Basierend auf der Struktur von sHdrA wurden eine hexamere Struktur für einen sHdrAA´B1B2C1C2-Komplex und zwei mögliche Reaktionsmechanismen postuliert.
Antiseren wurden gegen die Untereinheiten sHdrB1 und sHdrB2 generiert, um in zukünftigen chromatographischen Aufreinigungsversuchen, diese Proteine detektieren zu können. Die Antiseren wurden zudem genutzt, um die subzelluläre Lokalisation der sHdr-Untereinheiten in den Modellorganismen Hyphomicrobium denitrificans und Thioalkalivibrio thiocyanoxydans zu ermitteln.
Das bisher als hypothetisches Protein annotierte sHdrH konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal durch einen Immunoblot im Zellextrakt des chemolithhoautotrophen Organismus Thioalkalivibrio thiocyanoxydans nachgewiesen werden. Im erweiterten Rahmen dieser Arbeit wurde zudem durch reverse Genetik die Wichtigkeit des Gens shdrH für die Thiosulfatoxidation in H. denitrificans gezeigt.
In dieser Arbeit wurde ein erster Schritt zur biochemischen Charakterisierung des sHdr-Systems unternommen, indem die Untereinheit sHdrA aus Hyphomicrobium denitrificans kristallisiert und ihre Cofaktoren biophysikalisch untersucht wurden. sHdrA besitzt eine ähnliche Struktur wie die Thioredoxinreduktase-Domäne aus mHdrA. Diese Domäne bindet im mHdr-Komplex das bifurkierende FAD. Die Kristallstruktur von sHdrA zeigte, dass dieses Protein als Homodimer vorliegt und je Monomer ein [4Fe-4S]-Cluster und ein FAD bindet. Eine durch Elektronenspinresonanz—Spektroskopie verfolgte Redoxtitration ergab ein Redoxpotential zwischen -203 und -188 mV für das [4Fe-4S]-Cluster. Für die Redoxpaare des FAD-Cofaktors wurden in einer Redoxtitration Werte zwischen -174 und -156 mV für das Redoxpaar Hydrochinon/Semichinon und ein Redoxpotential zwischen -81 mV und -19 mV für das Redoxpaar Semichinon/Flavochinon gemessen. Daraus resultiert ein inverser Elektronenfluss in sHdrA im Vergleich zu mHdrA. Die Beobachtung eines stabilen Semichinons in sHdrA, was durch die unterschiedliche Polarität der FAD-koordinierenden Aminosäuren im Vergleich zu mHdrA erklärt werden kann, spricht gegen eine bifurkierende Eigenschaft von sHdrA. Basierend auf der Struktur von sHdrA wurden eine hexamere Struktur für einen sHdrAA´B1B2C1C2-Komplex und zwei mögliche Reaktionsmechanismen postuliert.
Antiseren wurden gegen die Untereinheiten sHdrB1 und sHdrB2 generiert, um in zukünftigen chromatographischen Aufreinigungsversuchen, diese Proteine detektieren zu können. Die Antiseren wurden zudem genutzt, um die subzelluläre Lokalisation der sHdr-Untereinheiten in den Modellorganismen Hyphomicrobium denitrificans und Thioalkalivibrio thiocyanoxydans zu ermitteln.
Das bisher als hypothetisches Protein annotierte sHdrH konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal durch einen Immunoblot im Zellextrakt des chemolithhoautotrophen Organismus Thioalkalivibrio thiocyanoxydans nachgewiesen werden. Im erweiterten Rahmen dieser Arbeit wurde zudem durch reverse Genetik die Wichtigkeit des Gens shdrH für die Thiosulfatoxidation in H. denitrificans gezeigt.
Classification (DDC)
570 Biowissenschaften, BiologieRelated Publications
https://doi.org/10.1111/febs.15505Ernst, Corvin: Charakterisierung des neuartigen mikrobiellen sHdr-Schwefeloxidationssystems. - Bonn, 2022. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5-67091
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5-67091
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In dieser Arbeit wurde ein erster Schritt zur biochemischen Charakterisierung des sHdr-Systems unternommen, indem die Untereinheit sHdrA aus Hyphomicrobium denitrificans kristallisiert und ihre Cofaktoren biophysikalisch untersucht wurden. sHdrA besitzt eine ähnliche Struktur wie die Thioredoxinreduktase-Domäne aus mHdrA. Diese Domäne bindet im mHdr-Komplex das bifurkierende FAD. Die Kristallstruktur von sHdrA zeigte, dass dieses Protein als Homodimer vorliegt und je Monomer ein [4Fe-4S]-Cluster und ein FAD bindet. Eine durch Elektronenspinresonanz—Spektroskopie verfolgte Redoxtitration ergab ein Redoxpotential zwischen -203 und -188 mV für das [4Fe-4S]-Cluster. Für die Redoxpaare des FAD-Cofaktors wurden in einer Redoxtitration Werte zwischen -174 und -156 mV für das Redoxpaar Hydrochinon/Semichinon und ein Redoxpotential zwischen -81 mV und -19 mV für das Redoxpaar Semichinon/Flavochinon gemessen. Daraus resultiert ein inverser Elektronenfluss in sHdrA im Vergleich zu mHdrA. Die Beobachtung eines stabilen Semichinons in sHdrA, was durch die unterschiedliche Polarität der FAD-koordinierenden Aminosäuren im Vergleich zu mHdrA erklärt werden kann, spricht gegen eine bifurkierende Eigenschaft von sHdrA. Basierend auf der Struktur von sHdrA wurden eine hexamere Struktur für einen sHdrAA´B1B2C1C2-Komplex und zwei mögliche Reaktionsmechanismen postuliert.
Antiseren wurden gegen die Untereinheiten sHdrB1 und sHdrB2 generiert, um in zukünftigen chromatographischen Aufreinigungsversuchen, diese Proteine detektieren zu können. Die Antiseren wurden zudem genutzt, um die subzelluläre Lokalisation der sHdr-Untereinheiten in den Modellorganismen Hyphomicrobium denitrificans und Thioalkalivibrio thiocyanoxydans zu ermitteln.
Das bisher als hypothetisches Protein annotierte sHdrH konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal durch einen Immunoblot im Zellextrakt des chemolithhoautotrophen Organismus Thioalkalivibrio thiocyanoxydans nachgewiesen werden. Im erweiterten Rahmen dieser Arbeit wurde zudem durch reverse Genetik die Wichtigkeit des Gens shdrH für die Thiosulfatoxidation in H. denitrificans gezeigt.},
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In dieser Arbeit wurde ein erster Schritt zur biochemischen Charakterisierung des sHdr-Systems unternommen, indem die Untereinheit sHdrA aus Hyphomicrobium denitrificans kristallisiert und ihre Cofaktoren biophysikalisch untersucht wurden. sHdrA besitzt eine ähnliche Struktur wie die Thioredoxinreduktase-Domäne aus mHdrA. Diese Domäne bindet im mHdr-Komplex das bifurkierende FAD. Die Kristallstruktur von sHdrA zeigte, dass dieses Protein als Homodimer vorliegt und je Monomer ein [4Fe-4S]-Cluster und ein FAD bindet. Eine durch Elektronenspinresonanz—Spektroskopie verfolgte Redoxtitration ergab ein Redoxpotential zwischen -203 und -188 mV für das [4Fe-4S]-Cluster. Für die Redoxpaare des FAD-Cofaktors wurden in einer Redoxtitration Werte zwischen -174 und -156 mV für das Redoxpaar Hydrochinon/Semichinon und ein Redoxpotential zwischen -81 mV und -19 mV für das Redoxpaar Semichinon/Flavochinon gemessen. Daraus resultiert ein inverser Elektronenfluss in sHdrA im Vergleich zu mHdrA. Die Beobachtung eines stabilen Semichinons in sHdrA, was durch die unterschiedliche Polarität der FAD-koordinierenden Aminosäuren im Vergleich zu mHdrA erklärt werden kann, spricht gegen eine bifurkierende Eigenschaft von sHdrA. Basierend auf der Struktur von sHdrA wurden eine hexamere Struktur für einen sHdrAA´B1B2C1C2-Komplex und zwei mögliche Reaktionsmechanismen postuliert.
Antiseren wurden gegen die Untereinheiten sHdrB1 und sHdrB2 generiert, um in zukünftigen chromatographischen Aufreinigungsversuchen, diese Proteine detektieren zu können. Die Antiseren wurden zudem genutzt, um die subzelluläre Lokalisation der sHdr-Untereinheiten in den Modellorganismen Hyphomicrobium denitrificans und Thioalkalivibrio thiocyanoxydans zu ermitteln.
Das bisher als hypothetisches Protein annotierte sHdrH konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal durch einen Immunoblot im Zellextrakt des chemolithhoautotrophen Organismus Thioalkalivibrio thiocyanoxydans nachgewiesen werden. Im erweiterten Rahmen dieser Arbeit wurde zudem durch reverse Genetik die Wichtigkeit des Gens shdrH für die Thiosulfatoxidation in H. denitrificans gezeigt.},
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