Charakterisierung des neuartigen mikrobiellen sHdr-Schwefeloxidationssystems

Abstract

Viele Archaeen und Bakterien von ökologischer Relevanz für den globalen Schwefelkreislauf enthalten ein neuartiges Schwefeloxidationssystem (sHdr), das Ähnlichkeiten zur Heterodisulfid-Reduktase aus methanogenen Archaeen ohne Cytochrome aufweist (mHdr). <br > In dieser Arbeit wurde ein erster Schritt zur biochemischen Charakterisierung des sHdr-Systems unternommen, indem die Untereinheit sHdrA aus <em>Hyphomicrobium denitrificans</em> kristallisiert und ihre Cofaktoren biophysikalisch untersucht wurden. sHdrA besitzt eine ähnliche Struktur wie die Thioredoxinreduktase-Domäne aus mHdrA. Diese Domäne bindet im mHdr-Komplex das bifurkierende FAD. Die Kristallstruktur von sHdrA zeigte, dass dieses Protein als Homodimer vorliegt und je Monomer ein [4Fe-4S]-Cluster und ein FAD bindet. Eine durch Elektronenspinresonanz—Spektroskopie verfolgte Redoxtitration ergab ein Redoxpotential zwischen -203 und -188 mV für das [4Fe-4S]-Cluster. Für die Redoxpaare des FAD-Cofaktors wurden in einer Redoxtitration Werte zwischen -174 und -156 mV für das Redoxpaar Hydrochinon/Semichinon und ein Redoxpotential zwischen -81 mV und -19 mV für das Redoxpaar Semichinon/Flavochinon gemessen. Daraus resultiert ein inverser Elektronenfluss in sHdrA im Vergleich zu mHdrA. Die Beobachtung eines stabilen Semichinons in sHdrA, was durch die unterschiedliche Polarität der FAD-koordinierenden Aminosäuren im Vergleich zu mHdrA erklärt werden kann, spricht gegen eine bifurkierende Eigenschaft von sHdrA. Basierend auf der Struktur von sHdrA wurden eine hexamere Struktur für einen sHdrAA´B1B2C1C2-Komplex und zwei mögliche Reaktionsmechanismen postuliert. <br > Antiseren wurden gegen die Untereinheiten sHdrB1 und sHdrB2 generiert, um in zukünftigen chromatographischen Aufreinigungsversuchen, diese Proteine detektieren zu können. Die Antiseren wurden zudem genutzt, um die subzelluläre Lokalisation der sHdr-Untereinheiten in den Modellorganismen <em>Hyphomicrobium denitrificans</em> und <em>Thioalkalivibrio thiocyanoxydans</em> zu ermitteln. <br > Das bisher als hypothetisches Protein annotierte sHdrH konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal durch einen Immunoblot im Zellextrakt des chemolithhoautotrophen Organismus <em>Thioalkalivibrio thiocyanoxydans</em> nachgewiesen werden. Im erweiterten Rahmen dieser Arbeit wurde zudem durch reverse Genetik die Wichtigkeit des Gens shdrH für die Thiosulfatoxidation in <em>H. denitrificans</em> gezeigt.