Die humane RNA-Helikase DDX19

Abstract

<em>Der mRNP-Export durch DDX19</em> <br /> Der nukleare Export von mRNPs (<em>messenger</em>-Ribonukleoproteine) wird in menschlichen Zellen durch die RNA-Helikase DDX19, zusammen mit dem Nukleoporin NUP214 und dem Exportfaktor Gle1 vermittelt. Durch frühere biochemische und genetische Experimente und durch die Aufklärung der molekularen Strukturen der an diesem Prozess beteiligten Proteinen und Kofaktoren konnte dieser Mechanismus bereits zu einem Großteil entschlüsselt werden. Bislang fehlten jedoch Daten zu der <em>in vivo</em> Kinetik lebender menschlicher Zellen. Um also die bestehenden Studien zu diesem Prozess zu ergänzen und zu vervollständigen, wurde im Folgenden eine detaillierte Analyse des DDX19-vermittelten mRNP Exports in menschlichen HeLa-Zellen <em>in vivo</em> unter Verwendung der Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie auf Einzelmolekülebene durchgeführt. Auf diese Weise konnten zwei Aspekte des Prozesses aufgeklärt werden.<br /> Als Erstes konnte die zugrundeliegende Kinetik des mRNP-Exports beobachtet werden. Zu diesem Zweck wurde eine stabile Zelllinie erzeugt, die das induzierbare Fusionsprotein bestehend aus DDX19 mit dem sogenannten HaloTag exprimiert, das die Visualisierung einzelner DDX19-Moleküle in HeLa-Zellen ermöglicht. Darüber hinaus wurde eine Zelllinie erzeugt, die das Fusionsprotein bestehend aus hnRNP A1 mit dem sogenannten SnapTag exprimiert. hnRNP A1 ist ein Ribonukleoprotein, das in der frühen Phase der RNP-Biogenese an mRNPs bindet und diese während ihrer Translokation durch die Kernporenkomplexe (NPCs) ins Zytoplasma begleitet. Die gleichzeitige Visualisierung der NPCs durch das Fusionsprotein, welches aus dem spezifischen Importfaktor NTF2 und dem fluoreszierenden Protein eGFP besteht, ermöglichte die Einzelmolekülanalyse der Bindungszeiten von DDX19-HaloTag und hnRNP A1-SnapTag-gebundenen mRNPs mit den NPCs. Dabei betrug die Bindungszeit von DDX19-HaloTag Proteinen an den NPCs ca. 45 ms und die von hnRNP A1-SnapTag-gebundenen mRNPs ca. 36 ms.<br /> Als Zweites konnte der Reaktionsablauf zwischen DDX19, mRNP, Gle1 und NUP214 beim mRNP-Export entschlüsselt und ein Reaktionszyklus für DDX19 auf der Grundlage der durchgeführten in vivo-Messungen festgelegt werden. Zu diesem Zweck mussten drei zusätzliche Zelllinien erzeugt werden, die jeweils eine mutierte DDX19-Variante induzierbar exprimierten. Die erste war die K385E-Mutante, die defizient in der Gle1-Bindung ist. Die zweite war die D223R-Mutante, die defizient in der NUP214 und mRNP-Bindung ist und die dritte war die E243Q-Mutante, die nicht in der Lage ist, ATP zu hydrolysieren. Die gleichzeitige Visualisierung von eGFP-NTF2 ermöglichte auch in diesen Zellen die Bestimmung der Bindungszeiten mit den Kernporen.<br /> Durch den Vergleich der Bindungszeiten und Bindungshäufigkeiten zwischen dem Wildtyp-Protein und den drei Mutanten konnte der Reaktionszyklus für den DDX19-vermittelten mRNP-Export aufgestellt werden. In diesem bindet DDX19 im ersten Schritt an das NUP214 und wird so auf der zytoplasmatischen Seite der Kernpore lokalisiert. Darüber hinaus führt die Bindung zu NUP214 zu einer erhöhten Affinität von DDX19 zu Gle1. Die darauffolgende Bindung an das Gle1 führt wiederum zu einer erhöhten Affinität von DDX19 zu mRNP, was zur Bindung an mRNP führt. Die anschließende ATP-Hydrolyse führt zur Entfernung der Exportfaktoren vom mRNP und der Freigabe in das Zytoplasma.<br /> <em>Die NLS des DDX19</em><br /> Moleküle mit einem Durchmesser ~5 nm oder einer Masse ~30 kDa benötigen Transportfaktoren, um das hydrophobe Innere der NPCs zu passieren. Die Bindungsstellen auf den Molekülen, die die Transportfaktoren binden, werden als Kernlokalisierungs- (NLS) bzw. Kernexportsignale (NES) bezeichnet. In dieser Arbeit konnte eine basenreiche Sequenz auf der C-terminalen Seite von DDX19 (425HRIGRTGRFGKR436) als potenzielle NLS identifiziert werden.

<strong>The human RNA helicase DDX19 : identification of its nuclear import signal and analysis of its role in mRNA export</strong> <br /> <em>The mRNP export by DDX19</em><br /> Nuclear export of mRNPs (messenger ribonucleoproteins) is mediated in human cells by the RNA helicase DDX19, together with the nucleoporin NUP214 and the export factor Gle1. Previous biochemical and genetic experiments and elucidation of the molecular structures of the proteins and cofactors involved in this process have already deciphered much of this mechanism. However, until now live cell data on the in vivo kinetics are still missing. Thus, to complement and complete the existing studies on this process, a detailed analysis of the DDX19-mediated mRNP export in human HeLa cells using high-speed fluorescence microscopy at the single-molecule level was performed in vivo. In this way, two aspects of the process were elucidated.<br /> First, the underlying kinetics of mRNP export could be observed. For this purpose, a stable cell line was generated expressing the inducible fusion protein consisting of DDX19 with the so-called HaloTag, which allows visualization of single DDX19 molecules in HeLa cells. In addition, a cell line was generated expressing the fusion protein consisting of hnRNP A1 with the so-called SnapTag. hnRNP A1 is a ribonucleoprotein that binds to mRNPs in the early phase of RNP biogenesis and accompanies them during their translocation through nuclear pore complexes (NPCs) into the cytoplasm. Simultaneous visualization of the NPCs by the fusion protein, which consists of the specific import factor NTF2 and the fluorescent protein eGFP, allowed single-molecule analysis of the binding times of DDX19-HaloTag and hnRNP A1-SnapTag-bound mRNPs with the NPCs. Here, the binding time of DDX19-HaloTag proteins to the NPCs was about 45 ms and that of hnRNP A1-SnapTag-bound mRNPs was about 36 ms.<br /> Second, the reaction pathway between DDX19, mRNP, Gle1, and NUP214 during mRNP export could be deciphered and a reaction cycle for DDX19 could be established based on the in vivo measurements performed. For this purpose, three additional cell lines had to be generated, each inducibly expressing a mutant DDX19 variant. The first was the K385E mutant deficient in Gle1 binding. The second was the D223R mutant deficient in NUP214 and mRNP binding, and the third was the E243Q mutant unable to hydrolyze ATP. Simultaneous visualization of eGFP-NTF2 allowed the determination of binding times with nuclear pores in these cells as well.<br /> By comparing the binding times and frequencies between the wild-type protein and the three mutants, the reaction cycle for DDX19-mediated mRNP export could be established. In this, DDX19 binds to NUP214 in the first step and is thus localized to the cytoplasmic side of the nuclear pore. Moreover, binding to NUP214 leads to an increased affinity of DDX19 for Gle1. Subsequent binding to Gle1 in turn leads to increased affinity of DDX19 to mRNP, resulting in binding to mRNP. Subsequent ATP hydrolysis leads to removal of export factors from mRNP and release into the cytoplasm.<br /> <em>The NLS of the DDX19</em><br /> Molecules with a diameter of around 5 nm or a mass larger than 30 kDa require transport factors to pass through the hydrophobic interior of NPCs. The binding sites on the molecules that bind the transport factors are referred to as nuclear localization signals (NLS) or nuclear export signals (NES). In this work, a base-rich sequence on the C-terminal side of DDX19 (425HRIGRTGRFGKR436) was identified as a potential NLS.