Das Cyclodepsipeptid FR900359: Ein Insektizid mit neuem Wirkmechanismus aus <em>Cand.</em> Burkholderia crenata und <em>Chromobacterium vaccinii</em>

Abstract

Sekundärmetabolite (SM) sind für ihr breites Spektrum an Bioaktivitäten bekannt und daher eine wichtige Quelle für neue Arzneimittelkandidaten. Neben ihrer Relevanz für die Therapie von Erkrankungen sind SM und ihre Produzenten ebenso von Bedeutung für ein gesundes Pflanzenwachstum und fungieren in der Landwirtschaft als natürlich vorhandene oder auch ausgebrachte Pflanzenschutzmittel. <br/> Das freilebende Bodenbakterium <em>Chromobacterium vaccinii</em> MWU205 ist dafür bekannt, dass es verschiedene SM produziert, darunter das zyklische Depsipeptid FR900359 (FR). FR ist ein hoch aktiver und selektiver Ga_q-Protein-Inhibitor, der in der pharmakologischen Forschung zur Untersuchung der Signalübertragung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren verwendet wird. Im Rahmen dieser Studie wurde die Analyse der FR/G_q Interaktion durch Kernspinresonanzspektroskopie innerhalb der Forschergruppe FOR2372 unterstützt, in dem vollständig ¹³C/¹⁵N-markiertes FR durch Isotopenfütterungs-Experimente hergestellt wurde. <br /> FR ist auch von ökologischer Bedeutung, da es G_q-Proteine von Säugetieren und Insekten hemmt, was für diese schwerwiegende physiologischen Folgen hat. Aufgrund ihrer hochgradig konservierten Struktur ist die G_q-Proteinfamilie ein hervorragendes ökologisches Zielmolekül für FR-produzierende Organismen und FR ist somit geeignet, um sich gegen ein breites Spektrum von Schadorganismen zu verteidigen. <br/> Ein wichtiges Ziel dieser Studie war es, das Metabolom von <em>C. vaccinii</em> nach bioaktiven SM zu mit besonderem Augenmerk auf neue FR-Derivate zu durchsuchen. Um ökologische Aspekte zu beleuchten, fokussierte sich diese Arbeit des Weiteren auf die FR-Produktion unter bodenähnlichen Bedingungen, und nachfolgend auf die Aktivität von FR gegenüber Bodenorganismen, z. B. bodenassoziierte Nematoden. <br/> Um die Plastizität des Metaboloms von <em>C. vaccinii</em> zu charakterisieren, wurden dessen Extrakte mittels Massenspektrometrie untersucht und in einem merkmalsbasierten molekularen Netzwerk verglichen. Die molekulare Familie von FR wurde im Netzwerk identifiziert und im Detail untersucht. Dieser Analyse folgend wurde ein neues FR-Derivat, FR-6, isoliert und seine exakte Struktur aufgeklärt. In pharmakologischen Assays unterdrückte FR-6 die G_q-Signalübertragung. <br /> Experimente, in denen <em>C. vaccinii</em> in Bodenextrakten kultiviert wurde zeigten, dass FR vom Produzenten an die Umgebung abgegeben und unter bodenähnlichen Bedingungen hergestellt wird. Dies ist auf den Boden übertragbar, so dass FR über seine Bioaktivität das umgebende Habitat beeinflusst. <br/> <em>In silico</em>-, <em>in vitro</em>- und <em>in vivo</em>-Untersuchungen lieferten Erkenntnisse zu ökologisch relevanten Wirkungen von FR auf bodenassoziierte Nematoden. Ga_q-Proteinsequenzen bodenassoziierter Nematoden wurden <em>in silico</em> auf ihre FR-Bindestelle hin untersucht, und eine Bindung der untersuchen Zielstrukturen wurde vorausgesagt. In der Tat konnte anschließend die Hemmung von heterolog exprimierten Ga_q-Proteinen der Nematoden <em>Caenorhabditis elegans</em> und <em>Heterodera schachtii</em> durch FR bewiesen werden. <em>In vivo</em>-Experimente zeigten, dass FR die Fortbewegung beider Nematoden reduziert, die Eiablage von <em>C. elegans</em> hemmt und das Schlüpfen von <em>H. schachtii</em> aus seinen Zysten verringert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass FR die Ausbreitung und Vermehrung von Nematoden im Boden reduzieren könnte. <br/> Diese Doktorarbeit stützt die Hypothese, dass <em>C. vaccinii</em> und das von ihm produzierte FR zu einem ökologischen Gleichgewicht im Boden beitragen könnten, und hierrüber das erfolgreiche Wachstum von Pflanzen fördern. Insgesamt weist auch diese Studie darauf hin, dass die mikrobielle Vielfalt im Erdreich von weitreichender Bedeutung ist.

<strong>The cyclic depsipeptide FR900359: An insecticide with a novel mode of action from <em>Cand.</em> Burkholderia crenata and <em>Chromobacterium vaccinii</em></strong><br/> Secondary metabolites (SM) are known for their broad spectrum of bioactivities, which makes them an important source for novel drug candidates. Besides their application for human health, SM and their producers are important to sustain plant health by functioning as natural existing or also applied crop protectants in agriculture. <br/> The free-living soil bacterium <em>Chromobacterium vaccinii</em> MWU205 is known to produce various SM, including the cyclic depsipeptide FR900359 (FR). FR is a potent and selective Gα_q protein inhibitor that is used extensively to investigate the intracellular signalling of G protein-coupled receptors. In the scope of this study, isotope feeding experiments were conducted to generate completely ¹³C/¹⁵N-labeled FR for detailed investigations of the FR/G_q interaction with nuclear magnetic resonance spectroscopy within the research group FOR2372. <br/> FR is also of ecological importance, as it binds to G_q proteins of mammals and insects, leadings physiological consequences for them. Due to its highly conserved structure, the G_q protein family is an excellent ecological target for FR producing organisms and FR is therefore suitable as a defence against a wide range of harmful organisms. <br/> The overall aim of this study was to search for bioactive SM in the genome and the metabolome of <em>C. vaccinii</em>, with special emphasize on new FR derivatives. To shed light on the ecological relevance of FR, its production was investigated under soil-like conditions. Subsequently, its bioactivity on soil organisms, e.g., nematodes, was assayed. <br/> To characterize the plasticity of the metabolome of <em>C. vaccinii</em>, its extracts were analysed using mass spectrometry and compared in a feature-based molecular network. The molecular family of FR was identified in the network and examined in detail. Following this analysis, a new FR derivative, FR-6, was isolated and its exact structure unambiguously established. In pharmacological assays, FR-6 suppressed G_q signalling. <br/> Following the investigation of the metabolome in laboratory media, experiments with soil-extracted solubilized organic matter were conducted to shed light on the ecological significance of FR production. These experiments revealed that FR is produced under soil-like conditions and a subsequent examination of its distribution confirmed that FR is excreted by <em>C. vaccinii</em>. Thus, FR is most likely present in <em>C. vaccinii</em>-inhabited soil and supposedly impacts the surrounding habitat. <br/> <em>In silico</em>, <em>in vitro</em> and <em>in vivo</em> studies provided insights into ecologically relevant effects of FR on soil-associated nematodes. A bioinformatic search and analysis of nematode Gα_q protein sequences predicted the binding of FR to the investigated target proteins. Indeed, the inhibition of heterologously expressed Gα_q proteins of the nematodes <em>Caenorhabditis elegans</em> and <em>Heterodera schachtii</em> by FR was subsequently demonstrated. <em>In vivo</em> experiments showed that FR reduces the locomotion of both nematodes. Furthermore, FR inhibited egg-laying of <em>C. elegans</em> and hatching of juvenile stage 2 of <em>H. schachtii</em> from its cysts. In conclusion, the results suggest that FR might reduce nematode dispersion and proliferation. <br/> This PhD thesis supports the hypothesis that <em>C. vaccinii</em> and the excreted FR in soil might contribute to an ecological equilibrium, maintaining and establishing the successful growth of plants. Overall, this study also indicates that microbial diversity in soil is of far-reaching importance.