Analyse der amorphen und amyloiden Aggregatsequestrierung in Mitochondrien

Abstract

Proteine müssen, um ihre Funktionen auszuführen, richtig gefaltet sein. Fehlgefaltete Proteine können Aggregate bilden, welche toxisch für die Zellen sind. Daher ist zum Schutz der Proteinhomöostase die Verhinderung der Aggregation zellulärer Polypeptide von wesentlicher Bedeutung. Dies ist jedoch nicht immer möglich und die Zelle muss derartige Aggregate detoxifizieren können. Durch die Ablagerung instabiler Proteine an bestimmten Sammelorten kann die Zelle sich schützen. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Aggregaten: amorphe und amyloide. Für amorphe mitochondriale Aggregate wurde in Saccharomyces cerevisiae beobachtet, dass sie sich im <em> intramitochondrial protein quality control compartment</em> (IMiQ) ansammeln. Auf diese Weise werden die Mitochondrien und die Zelle geschützt. Der Effekt von amorpher Proteinaggregation auf die Gesamtheit aller Proteine war bis jetzt jedoch unklar. Daher wurden in dieser Studie zwei unterschiedliche quantitative Massenspektrometrie-Ansätze benutzt, um die Veränderungen im mitochondrialen Proteom und die Bindungsaffinität der mitochondrialen Proteine zu den Aggregaten zu analysieren. Die Proteinmengen des mitochondrialen Proteoms veränderten sich größtenteils nicht. Jedoch zeigten die meisten Proteine eine erhöhte Bindungsaffinität zu den Aggregaten. Besonders Proteine der Zellatmung und des Proteinqualitätskontrollsystems (PQC) waren an den Aggregaten angereichert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Bildung von amyloiden Aggregaten in den Mitochondrien analysiert. Vergleichbar zum IMiQ sammelten sich amyloidogenen Proteine in wenigen Aggregaten im mitochondrialen Netzwerk an. Im Gegensatz zum IMiQ konnte diese Ansammlung die Zelle nur teilweise vor der von den Aggregaten ausgehenden Toxizität schützen. Sowohl für die amorphen als auch für die amyloiden Aggregate wurde eine Relokalisation der vorhandenen PQC-Proteine zu den Aggregaten hin beobachtet. Daher scheinen die Komponenten des PQC-Systems zu versuchen, die Aggregation zu verhindern und die löslichen Proteine von den instabilen Proteinen zu beschützen, in dem sie sich an den Aggregaten ansammeln. Dies ist jedoch nicht ausreichend für amyloide Aggregate, an denen sich über längere Zeit ein Großteil der PQC-Proteine ansammelte. So kann das PQC nicht seinen eigentlichen Funktionen nachgehen und die Zelle leidet. Daher bilden die amyloidogene Proteine ein toxischeres Aggregat als das IMiQ, welches nicht zu einer Detoxifizierung der instabilen Proteine führt. <br> Für die Bildung weniger Aggregate pro Zelle spielte die mitochondriale Fusion und Fission eine Rolle, unabhängig vom Aggregatstyp. Blockierung der mitochondrialen Fusion, wie in <em>fzo1&Delta;</em>, führte zu der Bildung von vielen kleinen Aggregaten im mitochondrialen Netzwerk. Blockierung der mitochondrialen Fission, wie in <em>fis1&Delta;</em>, führte hingegen zum Gegenteil, wenige große Aggregate. Der Wildtyp lag zwischen den beiden Extremen, aber es bildeten sich tendenziell eher wenige Aggregate. Die mitochondriale Dynamik ist ebenfalls involviert in der beobachteten asymmetrischen Vererbung der Aggregate. Im Wildtyp und in <em>fis1&Delta;</em> tendierten die Ablagerungsorte dazu sich am Nukleus zu bilden und so während der Zellteilung in der Mutterzelle zu bleiben. In <em>fzo1&Delta;</em> wurden die Aggregate nicht am Nukleus zurückgehalten und an die Tochterzelle vererbt. Somit ist eine funktionale mitochondriale Dynamik notwendig, um sicherzustellen, dass die Tochterzellen keine Aggregate erben. So können die Aggregate über die Zeit aus der Population verdünnt werden.

Proteins must be correctly folded in order to fulfil their functions. Misfolded proteins can form aggregates that are toxic to the cells. Thus, the prevention of protein aggregation is essential to protect protein homeostasis. However, this is not always possible, and the cell needs a way to detoxify aggregates. This is achieved by sequestering the unstable proteins into distinct deposit sites. In general, there two are different types of aggregates: amorphous and amyloid. For amorphous mitochondrial aggregates it was observed in <em>Saccharomyces cerevisiae</em> that they accumulate in the intramitochondrial protein quality control compartment (IMiQ). Thereby, the mitochondria and the cell are protected. The effect of the IMiQ formation on all mitochondrial proteins so far was unclear. Thus, in this study, two quantitative mass spectrometry approaches were used to analyse the changes in the mitochondrial proteome and the binding affinity of the mitochondrial proteins to aggregates. The protein levels of the whole mitochondrial proteome remained largely unchanged while most proteins showed an increased binding affinity to the aggregates. Especially proteins of the cellular respiration and of the protein quality control system (PQC) were increased at the aggregates. In the second part of this work, the formation amyloid aggregates inside mitochondria were analysed. Similar to the IMiQ, the amyloidogenic proteins accumulated in a few distinct aggregates within the mitochondrial network. In contrast to the IMiQ, this accumulation could only partially protect the cells from toxicity exerted from the aggregates. For both the amorphous and the amyloid aggregates a re-localisation of the mitochondrial chaperones to the aggregates could be observed. Therefore, it seems that the already expressed proteins of the PQC system try to prevent aggregation and protect the soluble proteins from unstable proteins by accumulating at the aggregates. This is insufficient for the amyloid aggregates since there the majority of the PQC proteins accumulated over longer time periods. Thus, the PQC cannot carry out their actual functions and the cell suffers. Therefore, amyloidogenic proteins form a more toxic aggregate than the IMiQ, which does not lead to detoxification of the unstable proteins.<br> The mitochondrial fusion and fission played a role in the formation of a few aggregates per cell, independent of aggregate type. Blocking of the mitochondrial fission, as in <em>fzo1&Delta;</em>, led to many small aggregates in the mitochondrial network. In contrast, blocking of the mitochondrial fusion, as in <em>fis1&Delta;</em>, led to the opposite, few small aggregates. The wild type was between the two extremes but tended to form smaller aggregates. The mitochondrial dynamic is also involved in the observed asymmetric inheritance of the aggregates. In the wild type and in <em>fis1&Delta;</em> the deposition site tended to form at the nucleus and thus, was retained in the mother cell during cell division. In <em>fzo1&Delta;</em> the aggregates were not retained at the nucleus and were inherited to the daughter cell. Therefore, functional mitochondrial dynamics are necessary to ensure that daughter cells do not inherit aggregates and that the aggregates can be diluted from the population over time.