Antibiotic-induced cellular effects in <em>Wolbachia</em>: Insights from cell wall biosynthesis inhibitors and corallopyronin A

Abstract

Anti-Wolbachia therapy is a powerful strategy to treat the human infections lymphatic filariasis and onchocerciasis, neglected tropical diseases caused by filarial worms that are major drivers of morbidity and poverty. Wolbachia, obligate endobacteria of these worms, are essential for embryogenesis, larval development, and adult survival. Despite their highly reduced genome and lack of a canonical cell wall, Wolbachia retain key enzymes for lipid II synthesis.<br /> This thesis investigates the cellular effects of cell wall biosynthesis inhibitors and corallopyronin A (CorA) in Wolbachia. The first publication “In vitro extracellular replication of Wolbachia endobacteria” establishes a host cell-free Wolbachia culture. Host cell lysate enabled extracellular growth of Wolbachia for 12 days. Here, fosfomycin, which inhibits the first dedicated enzyme in lipid II biosynthesis (MurA), induced enlarged extracellular Wolbachia, as seen for intracellular Wolbachia, whereas bacitracin, vancomycin, and ampicillin had no observable effects.<br /> The second publication “MraY inhibitor muraymycin D2 and derivatives induce enlarged cells in obligate intracellular Chlamydia and Wolbachia and break persistence in Chlamydia” explores the cellular effects of muraymycins, inhibitors of MraY, the enzyme catalyzing the first membrane-bound step of lipid II biosynthesis. Two muraymycin derivatives inhibited growth of Wolbachia and induced an enlarged phenotype, similar to fosfomycin, identifying MraY as a new wolbachial target for drug development.<br /> The third publication “No resistance development against corallopyronin A in Wolbachia in C6/36 cell culture” assesses the potential for resistance development against the RNA polymerase inhibitor CorA, which is in preclinical development against human filarial infections. Wolbachia were exposed to CorA for 245 days. No reduction in CorA efficacy was observed, suggesting a low frequency of mutation to resistance and supporting its further development.<br /> The manuscript “Improved RNA preparation for RNA-seq of the intracellular bacterium Wolbachia wAlbB” identifies conditions that yielded high-quality RNA for RNA-seq, with custom-designed riboPOOLs effectively depleting rRNA. Combined with host cell mRNA depletion using Dynabeads, 30.2% of reads mapped to Wolbachia, a 300-fold increase compared to our first RNA-seq experiment.<br /> By investigating the cellular effects of cell wall biosynthesis inhibitors and CorA in Wolbachia, this thesis provides insights into Wolbachia biology. Key findings include the establishment of a host cell-free Wolbachia culture, muraymycin-induced enlargement of Wolbachia, further supporting that lipid II is essential for their cell division, and the lack of resistance development against CorA in prolonged cell culture. Additionally, an optimized workflow for RNA-seq of Wolbachia will enable detailed transcriptomic studies, including the investigation of cellular effects of antibiotics.

Die Anti-Wolbachia-Therapie hat sich als effektive Strategie zur Behandlung von Infektionen des Menschen mit lymphatischer Filariose und Onchozerkose etabliert. Diese zählen zu den vernachlässigten Tropenkrankheiten, werden durch Filarienwürmer verursacht und stellen eine bedeutende Ursache für Morbidität und Armut dar. Wolbachia (im Deutschen auch: Wolbachien), obligate Endobakterien dieser Würmer, sind für die Embryogenese, die Larvenentwicklung und das Überleben der adulten Würmer unerlässlich. Obwohl ihr Genom stark reduziert ist und keine kanonische Zellwand vorliegt, verfügen Wolbachien über Schlüsselenzyme für die Lipid-II-Biosynthese.<br /> In dieser Dissertation werden die zellulären Effekte von Zellwandbiosynthese-Inhibitoren und Corallopyronin A (CorA) in Wolbachien untersucht. Das erste Paper „In vitro extracellular replication of Wolbachia endobacteria“ beschreibt die Etablierung einer wirtszellfreien Wolbachia-Kultur. Mithilfe von Wirtszelllysat wurde extrazelluläres Wachstum von Wolbachien für bis zu 12 Tage ermöglicht. Fosfomycin, welches das erste dedizierte Enzym der Lipid-II-Biosynthese (MurA) hemmt, induzierte eine Vergrößerung der extrazellulären Wolbachien, wie sie zuvor für intrazelluläre beobachtet wurde, während Bacitracin, Vancomycin und Ampicillin keine beobachtbaren Effekte hatten.<br /> Das zweite Paper „MraY inhibitor muraymycin D2 and derivatives induce enlarged cells in obligate intracellular Chlamydia and Wolbachia and break persistence in Chlamydia“ untersucht die zellulären Effekte von Muraymycinen, Inhibitoren von MraY, dem Enzym, das den ersten membrangebundenen Schritt der Lipid-II-Biosynthese katalysiert. Zwei Muraymycin-Derivate hemmten das Wachstum von Wolbachien in Zellkultur und induzierten einen vergrößerten Phänotyp, ähnlich wie Fosfomycin, wodurch MraY als neue Zielstruktur für die Entwicklung von Medikamenten gegen Wolbachien identifiziert wurde.<br /> Das dritte Paper „No resistance development against corallopyronin A in Wolbachia in C6/36 cell culture“ bewertet das Potenzial zur Resistenzentwicklung gegenüber dem RNA-Polymerase-Inhibitor CorA, der sich in der präklinischen Entwicklung gegen humane Filarieninfektionen befindet. Wolbachien wurden 245 Tage lang mit CorA behandelt. Keine Abnahme der Wirksamkeit von CorA wurde beobachtet, was auf eine geringe Frequenz resistenzvermittelnder Mutationen hinweist und die Weiterentwicklung des Wirkstoffs unterstützt.<br /> Das Manuskript „Improved RNA preparation for RNA-seq of the intracellular bacterium Wolbachia wAlbB“ identifiziert Bedingungen, die qualitativ hochwertige RNA für RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) liefern, wobei maßgeschneiderte riboPOOLs die rRNA effektiv depletierten. In Kombination mit der Depletion der Wirtszell-mRNA mittels Dynabeads konnten 30,2% Wolbachia-Reads erzielt werden, was einem 300-fachen Anstieg im Vergleich zu unserem ersten RNA-Seq-Experiment entspricht.<br /> Mit der Untersuchung der zellulären Effekte von Zellwandbiosynthese-Inhibitoren und CorA in Wolbachia liefert diese Dissertation Einblicke in die Biologie von Wolbachien. Zu den wichtigsten Ergebnissen gehören die Etablierung einer wirtszellfreien Wolbachia-Kultur, die Muraymycin-induzierte Vergrößerung von Wolbachien, was die essenzielle Rolle von Lipid II in ihrer Zellteilung weiter untermauert, und das Ausbleiben einer Resistenzentwicklung gegenüber CorA in Langzeitkultur. Darüber hinaus ermöglicht ein optimierter Prozess für RNA-Seq von Wolbachien zukünftig detaillierte Transkriptomstudien, einschließlich der Untersuchung zellulärer Effekte von Antibiotika.