A Comprehensive Analysis of Differential Cellular Effects of B-domain-deleted and Full-length FVIII Expression in HEK293 Cells

Abstract

Gene therapy has emerged as a promising approach for Hemophilia A and B, enabling sustained production of clotting factors and reducing reliance on frequent FVIII infusions. While Hemophilia B therapies targeting Factor IX show durable outcomes, Hemophilia A treatments using B-domain-deleted Factor VIII (BDD-FVIII), a truncated form adapted for adeno-associated virus delivery, often show reduced persistence. This study investigates cellular and molecular mechanisms underlying this disparity by comparing BDD-FVIII with full-length FVIII (FL-FVIII). <br/> Using stably transfected HEK293 cells, we evaluated expression and secretion levels. BDD-FVIII showed improved expression, secretion and lower endoplasmic reticulum (ER) retention, likely due to its smaller size and reduced interaction with chaperones such as Calnexin and LMAN1. <br/> We further conducted immunofluorescence co-localization studies, targeted chemical treatments, and gene knockouts of key trafficking regulators. These experiments revealed that FL-FVIII depends on classical ER-to-Golgi transport, while BDD-FVIII interacts less with early secretory pathway components. These findings demonstrate that FL- and BDD-FVIII engage distinct intracellular trafficking routes and quality control mechanisms. <br/> Deletion of the FVIII B-domain significantly altered cellular behavior beyond secretion. BDD-FVIII-expressing cells showed reduced proliferation alongside activation of stress-related pathways, as confirmed by proliferation assays and RNA-seq analysis. Metabolic profiling showed that FL-FVIII imposes a greater folding and energetic burden due to its complex structure. FL-FVIII cells exhibited high mitochondrial ATP production but low residual ATP, indicating energy exhaustion. In contrast, BDD-FVIII cells maintained higher residual ATP with lower mitochondrial ATP, reflecting better energy efficiency. <br/> Transcriptomic analysis revealed distinct gene expression profiles between FL-FVIII and BDD-FVIII, affecting pathways involved in cell cycle regulation, stress response, and metabolism. Notably, we identified a range of differentially regulated molecules between the two variants, including transcriptional regulators, kinases, enzymes, and chemical drugs. Among these, one compound previously used in gene therapy for Hemophilia A emerged as particularly interesting, as it has been shown to mitigate therapy-induced stress. This raises the possibility that such compounds could contribute to stabilizing BDD-FVIII by promoting a transcriptional and functional shift toward the FL-FVIII profile. These findings highlight the potential for therapeutic modulation using small molecules or kinase inhibitors to target stress-adaptive pathways. <br/> Taken together, our results show that although the FVIII B-domain is not essential for coagulation, it plays a broader role in regulating secretion, metabolic homeostasis, and long-term cell adaptation. This study provides insight into the differential cellular effects of BDD- and FL-FVIII and may support the development of more targeted and personalized gene therapy strategies for Hemophilia A.

Gentherapie stellt einen vielversprechenden Therapieansatz für Hämophilie A und B dar, da sie eine anhaltende Produktion von Gerinnungsfaktoren ermöglicht und die Abhängigkeit von häufigen Infusionen von FVIII-Konzentraten verringert. Während Therapien für Hämophilie B, die auf den Faktor IX (FIX) abzielen, langanhaltende und stabile Langzeitergebnisse zeigen, weisen Behandlungen für Hämophilie A, die auf dem B-Domänen-deletierten Faktor VIII (BDD-FVIII) basieren, einer verkürzten Form, die für die Verpackung in Adeno-assoziierte Viren (AAV) optimiert wurde, häufig eine reduzierte Persistenz auf. Ziel dieser Studie ist es, die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die zu dieser Diskrepanz beitragen, indem BDD-FVIII mit dem Faktor VIII in voller Länge (FL-FVIII) verglichen wird. <br/> Durch die Verwendung stabil transfizierter HEK293-Zellen wurden Expressionsniveaus, intrazellulärer Transport, Sekretionseffizienz und zelluläre Stressreaktionen analysiert. BDD-FVIII zeigte eine verbesserte Sekretion und geringere Retention im endoplasmatischen Retikulum, vermutlich aufgrund einer reduzierten Interaktion mit Chaperonen wie Calnexin und LMAN1. <br/> Des Weiteren haben wir Immunfluoreszenz-Kolokalisationsstudien, gezielte chemische Störungen und Gen-Knockouts von wichtigen Regulatoren für den Transport beim Menschen durchgeführt. Die Studien haben offenbart, dass FL-FVIII auf den traditionellen Transportweg vom ER zum Golgi angewiesen ist, während BDD FVIII weniger mit den frühen Komponenten des sekretorischen Wegs in Wechselwirkung tritt. Die Resultate verdeutlichen, dass FL- und BDD-FVIII verschiedene interne Transportrouten und Qualitätskontrollmechanismen verwenden. <br/> Die Entfernung der FVIII B-Domäne führte zu einer signifikanten Veränderung des zellulären Verhaltens, die über die Sekretion hinausging. Zellen, die BDD-FVIII exprimieren, wiesen eine verminderte Vermehrung und Aktivierung von stressbedingten Signalwegen auf, was mittels RNA-Seq und Proliferationstests nachgewiesen wurde und auf einen gesteigerten intrazellulären Stress hindeutet. Die Analyse des Stoffwechselprofils ergab, dass FL-FVIII aufgrund seiner komplizierten Struktur zu einer erhöhten Falt- und Energiebelastung führt. Die FL-FVIII-Zellen wiesen eine erhöhte Produktion von mitochondrialem ATP auf, jedoch einen geringen Rest-ATP-Spiegel, was auf einen Energiemangel hindeutet. Im Unterschied dazu wiesen BDD-FVIII-Zellen trotz einer niedrigeren mitochondrialen Leistung ein höheres intrazelluläres ATP auf, was auf eine verbesserte Energieeffizienz hindeutet. <br/> Die Analyse des Transkriptoms offenbarte verschiedene Genexpressionsmuster zwischen FL-FVIII und BDD-FVIII, die sich auf Signalwege beziehen, die die Regulation des Zellzyklus, die Stressreaktion und den Stoffwechsel beeinflussen. Auffällig war, dass wir diverse Moleküle mit unterschiedlichen Regulierungsmechanismen in beiden Varianten feststellten, wie zum Beispiel Transkriptionsregulatoren, Kinasen, Enzyme und chemische Substanzen. Eine herausragende Verbindung in diesem Zusammenhang war bereits in der Gentherapie für Hämophilie A verwendet worden, da sie nachweislich die durch die Therapie verursachten Stressreaktionen reduziert. Das könnte dazu führen, dass diese Verbindungen dazu beitragen, die Stabilität von BDD-FVIII zu verbessern, indem sie eine Veränderung in der Transkription und Funktion unterstützen, die zu einem FL-FVIII-Profil führt. Die Resultate zeigen, dass eine gezielte Beeinflussung stressadaptiver Signalwege durch kleine Moleküle oder Kinaseinhibitoren therapeutisch moduliert werden kann. <br/> Insgesamt deuten unsere Resultate darauf hin, dass die FVIII-B-Domäne zwar nicht unverzichtbar für die Blutgerinnung ist, jedoch eine umfassendere Funktion bei der Kontrolle der Sekretion, der metabolischen Balance und der langfristigen Zellanpassung hat. Die Untersuchung bietet einen Überblick über die verschiedenen zellulären Auswirkungen von BDD- und FL-FVIII und könnte dazu beitragen, maßgeschneiderte Gentherapiestrategien für Hämophilie A zu entwickeln.