Heister, Thomas: Untersuchungen zur regulierbaren Genexpression und Herstellung einer Zellinie zur induzierbaren Expression des Herpes Simplex Virus Typ-1(HSV-1) Immediate Early (IE) 3 Gens. - Bonn, 2000. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-01610
@phdthesis{handle:20.500.11811/1657,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-01610,
author = {{Thomas Heister}},
title = {Untersuchungen zur regulierbaren Genexpression und Herstellung einer Zellinie zur induzierbaren Expression des Herpes Simplex Virus Typ-1(HSV-1) Immediate Early (IE) 3 Gens},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2000,
note = {Die Herstellung einer Helfervirus-freien Verpackungszellinie für HSV-1 Amplikon Vektoren erfordert die induzierbare Genexpression verschiedener HSV-1 Hauptregulatorgene, da die meisten Gene für zytotoxische Proteine kodieren, wie zum Beispiel das IE3 Genprodukt ICP4. Um den reprimierenden Effekt einer lox / Stop / lox - Kassette zu überprüfen, wurden verschiedene Plasmide konstruiert, in denen entweder das IE3 Gen oder ein Reportergen (GFP, LacZ) durch die Insertion der Stop-Kassette, mit den flankierenden lox-Signalen, von dem starken Cytomegalovirus (CMV) Immediate-Early (IE) 1 Enhancer / Promoter getrennt ist. Transiente und stabile Transfektionen in VERO-Zellen mit dem IE3 - oder den Reportergen - Konstrukten zeigten, dass die Genexpression im nicht-induzierten Zustand vollkommen reprimiert ist. Dagegen konnten durch die Cre-Rekombinase vermittelte Deletion der lox flankierten Stop-Kassette Expressionsstärken erzielt werden, die den Expressionsstärken der Kontrollkonstrukte (ohne lox flankierte Stop-Kassette) entsprachen. Desweiteren konnte die vollständige Repression der Replikation einer IE3 Deletionsmutante (HSV d120) in nicht-induzierten VERO-IE3 Zellen gezeigt werden. Die anschliessende Transfektion dieser Zellen mit einem Cre-Rekombinase exprimierenden Plasmid resultierte in einer Reaktivierung der HSV d120 Replikation. Die Repression, sowie die Reaktivierung der HSV d120 Replikation nach Cre - Rekombinase vermittelter Deletion der lox / Stop / lox - Kassette, konnte über einen Zeitraum von 5 Tagen beobachtet werden. Die Verpackung eines GFP / CRE - exprimierenden Amplikon Vektors mittels HSV d120 als Helfervirus in VERO-IE3 Zellen resultierte in einem Amplikon-Titer von 1 x 105 transduzierenden Einheiten pro ml (TU / ml) und einem Verhältnis von Amplikon zu Helfervirus von 5 : 1. In 0.5 ml der geernteten Vektorstocks konnten keine Revertanten mit Wildtyp HSV-1 Phänotyp detektiert werden. Die VERO-IE3 Zellinie erlaubt die induzierbare Replikation von HSV-1 IE3 Deletionsmutanten und verdeutlicht die Bedeutung des Cre / lox -Rekombinationssystems bei der Herstellung stabiler Zellinien für die Expression zytotoxischer Genprodukte.},
url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/1657}
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