Untersuchungen zur regulierbaren Genexpression und Herstellung einer Zellinie zur induzierbaren Expression des Herpes Simplex Virus Typ-1</nobr>(HSV-1)</nobr> Immediate Early (IE) 3 Gens

Abstract

Die Herstellung einer Helfervirus-freien Verpackungszellinie für HSV-1 Amplikon Vektoren erfordert die induzierbare Genexpression verschiedener HSV-1 Hauptregulatorgene, da die meisten Gene für zytotoxische Proteine kodieren, wie zum Beispiel das IE3 Genprodukt ICP4. Um den reprimierenden Effekt einer lox / Stop / lox - Kassette zu überprüfen, wurden verschiedene Plasmide konstruiert, in denen entweder das IE3 Gen oder ein Reportergen (GFP, LacZ) durch die Insertion der Stop-Kassette, mit den flankierenden lox-Signalen, von dem starken Cytomegalovirus (CMV) Immediate-Early (IE) 1 Enhancer / Promoter getrennt ist. Transiente und stabile Transfektionen in VERO-Zellen mit dem IE3 - oder den Reportergen - Konstrukten zeigten, dass die Genexpression im nicht-induzierten Zustand vollkommen reprimiert ist. Dagegen konnten durch die Cre-Rekombinase vermittelte Deletion der lox flankierten Stop-Kassette Expressionsstärken erzielt werden, die den Expressionsstärken der Kontrollkonstrukte (ohne lox flankierte Stop-Kassette) entsprachen. Desweiteren konnte die vollständige Repression der Replikation einer IE3 Deletionsmutante (HSV d120) in nicht-induzierten VERO-IE3 Zellen gezeigt werden. Die anschliessende Transfektion dieser Zellen mit einem Cre-Rekombinase exprimierenden Plasmid resultierte in einer Reaktivierung der HSV d120 Replikation. Die Repression, sowie die Reaktivierung der HSV d120 Replikation nach Cre - Rekombinase vermittelter Deletion der lox / Stop / lox - Kassette, konnte über einen Zeitraum von 5 Tagen beobachtet werden. Die Verpackung eines GFP / CRE - exprimierenden Amplikon Vektors mittels HSV d120 als Helfervirus in VERO-IE3 Zellen resultierte in einem Amplikon-Titer von 1 x 10⁵ transduzierenden Einheiten pro ml (TU / ml) und einem Verhältnis von Amplikon zu Helfervirus von 5 : 1. In 0.5 ml der geernteten Vektorstocks konnten keine Revertanten mit Wildtyp HSV-1 Phänotyp detektiert werden. Die VERO-IE3 Zellinie erlaubt die induzierbare Replikation von HSV-1 IE3 Deletionsmutanten und verdeutlicht die Bedeutung des Cre / lox -Rekombinationssystems bei der Herstellung stabiler Zellinien für die Expression zytotoxischer Genprodukte.

<b>Cre-recombinase induced expression of the cytotoxic herpes simplex virus-type 1 immediate-early 3 gene</b><br /> The generation of a packaging cell-line for HSV-1-based amplicon vectors requires inducible expression of several of the HSV-1 key regulatory genes, because many of these encode cytotoxic proteins such as the IE3 gene product (ICP4). To investigate the tightness of repression of a lox / stop / lox-cassette, we constructed plasmids that contain either the HSV-1 IE3 gene , or a reporter gene (GFP, lacZ) separated from the strong cytomegalovirus immediate-early enhancer / promoter by an intervening stop-cassette that is flanked by lox sites. Transient and stable transfection of VERO cells with the IE3 construct, or the reporter gene constructs, demonstrated that in the non-induced state gene expression is completely repressed. Upon Cre recombinase-mediated deletion of the lox-flanked stop-cassette, expression levels reached those of control constructs that did not contain the lox-flanked stop-cassette. Furthermore, replication of HSV-1 dl120, an IE3 deletion mutant, was completely repressed in non-induced, stable VERO-IE3 cells. Transfection of these cells with a plasmid that expresses Cre recombinase, resulted in the reactivation of virus replication. Reactivation of virus replication by Cre-mediated IE3 induction could be achieved up to 5 days post infection with HSV-1 dl120. Packaging of a GFP / Cre-expressing amplicon vector using VERO-IE3 cells and HSV-1 dl120 as helper virus resulted in amplicon stocks with titers of ~ 1x10⁵ transducing units / ml and a ratio of amplicon to helper virus of up to 5 : 1. No revertants with wild type HSV-1 phenotype were detected in 0.5 ml of the harvested vector stocks. The VERO-IE3 cell-line allows inducible replication of HSV-1 IE3-deletion mutants and demonstrates the potential of the Cre / lox recombination system for generating cell lines that contain genes which encode cytotoxic proteins.