Untersuchungen zu Kultivierung, Transformation und Fermentation von <i>Wolffia</i> spec.

Abstract

Die Wasserlinse <i>Wolffia</i> spec. aus der Familie der <i>Lemnaceae</i> scheint hinsichtlich mehrerer Parameter als effektives pflanzliches Expressionssystem für Proteine geeignet zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit sollten grundlegende Kulturdaten wie Medien, Labortauglichkeit, Biomassezuwachs, Vitalitätsmessung, Transformierbarkeit und Fermentationsparameter von zwölf <i>Wolffia</i>-Spezies bzw. Klonen evaluiert werden.<br /> Da klassische Sterilisationsverfahren nicht einsetzbar waren, wurde ein Dekontaminationsprotokoll auf Antibiotikabasis entwickelt. Toleranzen und Sensitivitäten gegenüber antibiotisch wirksamen Substanzen verschiedener Wirkstoffgruppen konnten für <i>Wolffia</i> spec. spezifiziert werden. Für die schnelle und einfache Messung der Vitalität konnte das Fluoreszenzmeter PAM-2000 herangezogen werden. Die ermittelten Yield-Werte korrelierten zuverlässig mit den Erhebungen des zuvor entwickelten Bonitursystems. Spätere Versuche zeigten, daß Vitalitätsmessungen mit RAMOS für die Evaluierung von Wachstumsparametern und deren digitale Dokumentation sehr gut geeignet sind.<br /> Als sehr gute Labor-Spezies stellte sich im Verlauf der Experimente <i>W. australiana</i> heraus: Sie realisierte einen hohen Biomassezuwachs und verhielt sich auch unter dem Aspekt der statistisch belegten jahreszeitbedingten Wachstumsschwankungen als konstante und zuverlässige Laborkultur (15,6 % Tageszuwachs auf SH-Medium bezogen auf 15 Tage). Eine arbeitsextensive Langzeitkultur auf Festmedium war ebenso unproblematisch wie das erneute Überführen in Flüssigmedium. Als geeignetes Kultursystem erwiesen sich mit Aluminiumfolie verschlossene, sterile 250 ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml Mediumvolumen.<br /> Verschiedene <i>Wolffia</i>-Spezies konnten mit Hilfe von <i>Agrobacterium tumefaciens</i> teilweise und auch vollständig mit dem gus-Gen transformiert werden. Eine Transformation mit GFP konnte nicht bestätigt werden. Nach der Optimierung des Verfahrens der Agrobakterien-Infiltration konnte ein positives Signal auf Transkriptionsebene für <i>W. australiana</i> nach Transformation mittels <i>A. tumefaciens</i> C58/pCAMBIA 1301 detektiert werden. Proteindaten nach Bradford wurden ebenso dokumentiert wie die Messwerte des MUG-Assays, welche als Leitparameter zukünftiger Experimente dienen können. Für den Nachweis stabiler Transformation wurde ein Selektionsprotokoll entwickelt, welches den allelopathischen Wechselwirkungen einer zu selektierenden <i>Wolffia</i>-Kultur Rechnung trägt.<br /> Um die Erzeugung von unerwünschten Chimären zu vermeiden, wurden zunächst verschiedene Kallus-Induktionsmedien evaluiert. Die Entwicklung kallöser Strukturen und deren Proliferation konnte unter einem NAA/BAP-Regime beobachtet werden. Die Co-Kultivierung mit <i>A. tumefaciens</i> GV3101/pCAMBIA 1301 erbrachte vollständig blaue Strukturen nach X-Gluc-Färbung. Regenerationsparameter verbleiben als noch zu evaluierende Faktoren.<br /> Für die Fermentation verschiedener <i>Wolffia</i>-Spezies konnten vitale Pflanzen sowohl im Biobeutel-System als auch im MiniPerm über längere Zeiträume (bis drei Monate) zuverlässig erhalten werden. Die Daten des im Hause entwickelten <i>Wolffia</i>-Fermenters JACES dienten als Grundlage für die Optimierung eines <i>Wolffia</i>-Airlift-Fermenters, der den Ansprüchen des Expressionssytems genügt sowie ein einfaches Upscaling ermöglicht. Auf der Basis der in dieser Arbeit evaluierten Daten konnten erste Expressionsdaten einer entwickelten Immuntoxinkassette in <i>W. australiana</i> (Becker, unpubl. Daten) erzeugt werden. Das Expressionssystem <i>Wolffia</i> besitzt demnach das Potential für die Produktion pharmazeutisch relevanter Proteine und stellt somit eine realistische Alternative auf dem Gebiet des Molecular Pharming dar.

<strong>Investigation of cultivation, transformation and fermentation of <i>Wolffia</i> spec.</strong><br /><i>Wolffia</i> spec. (duckweed) belonging to the family of <i>Lemnaceae </i>is discussed as a promising innovative plant expression system for pharmaceutical proteins. Within the scope of this thesis basic cultivation parameters (like media, laboratory usage, biomass production, vitality), transformation methods and fermentation systems were investigated for twelve clones of different <i>Wolffia</i> species.<br /> For sterile cultivation a decontamination protocol based on antibiotics was developed, as the classic methods for sterilization (such as ethanol or sodiumhypochlorit) failed. Tolerance as well as sensitivity of all <i>Wolffia</i> species was determined for different drug classes. For a fast and easy detection of vitality, the fluorescence meter PAM-2000 was used. The yield data measured with this method were highly correlated with the data from the subsequently developed rating system. Furthermore, the RAMOS proved to be an excellent tool for the evaluation and digital documentation of cultivation parameters. <br /> During the testing <i>W. australiana </i>turned out to be a highly qualified species for laboratory usage. Biomass production was found to be constant and reliable (with a daily increase of 15.6 % on SH medium considering 15 days), despite significant fluctuations within the annual rhythm. Long-term culture on solid media as well as the transfer back into liquid media were unproblematic. For cultivation in liquid media an appropriate cultivation system was a 250 ml sterile Erlenmeyer flask with 100 ml medium closed with aluminium foil.<br /> Different <i>Wolffia</i> species could be successfully transformed partially and completely via <i>Agrobacterium tumefaciens</i> containing the <i>gus</i>-gene. A <i>gfp</i>-induced fluorescence could not be separated from the native fluorescence in <i>Wolffia</i> plants. After optimizing the method of agrobacteria-infiltration through low-pressure, a positive RT-PCR-signal could be detected after <i>gus</i>-gene transformation with <i>A. tumefaciens</i> C58/pCAMBIA 1301. Protein data after Bradford and data from the MUG-assay were determined and can be used as guidelines for further experiments. For the verification of stable transformants, a selection protocol which takes the allelopathic interactions into consideration was developed.<br /> To avoid unwanted chimera during transformation callus induction is a suitable tool. To induce calli, different phytohormones were tested at various concentrations. However, it was not successful in most cases. Proliferation could only be observed in <i>W. australiana</i> under NAA/BAP influence on SHI medium. The transformation of these callus-like structures with <i>gus-</i>transgenic agrobacteria was successful. The regeneration of the calli should be part of further research.<br /> The Biobag and MiniPerm fermentation systems allowed reliable cultivation of vital and growing <i>Wolffia</i> plants for more than three month. The developed <i>Wolffia</i>-bioreactor JACES and its settings were the basis for the optimization of an airlift-bioreactor, which fulfils the requirements of submerged living plants and allows uncomplicated upscaling.<br /> Based on the data obtained in this work, for the first time it was possible to detect a transcription signal after transformation with agrobacteria containing a developed imunotoxin cassette in <i>W. australiana</i> (Becker unpub. data). This result shows that <i>Wolffia</i> has the potential for the expression of pharmaceutical proteins and that <i>Wolffia</i> is an innovative alternative for molecular pharming applications.