Tetsch, Larissa: Laccasen und Laccasegene des acidophilen Ascomyceten Hortaea acidophila. - Bonn, 2005. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-06595
@phdthesis{handle:20.500.11811/2338,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-06595,
author = {{Larissa Tetsch}},
title = {Laccasen und Laccasegene des acidophilen Ascomyceten Hortaea acidophila},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2005,
note = {Hortaea acidophila ist ein acidophiler Ascomycet der Ordnung Dothideales und bildet DHN-Melanin, an dessen Synthese u. a. Laccasen beteiligt sind. Bei diesen Enzymen handelt es sich um Polyphenoloxidasen mit vier Kupferatomen im katalytischen Zentrum. Laccasen werden industriell u. a. zur Papierbleiche, in der Textilindustrie und zur Modifikation von Naturstoffen genutzt. Da H. acidophila bei einem pH-Wert von 0,6 wachsen kann, ist davon auszugehen, dass die gebildeten Laccasen an saure Umweltbedingungen angepasst sind und somit interessante Eigenschaften für eine biotechnologische Nutzung besitzen. Um eine heterologe Expression der Laccasen zu ermöglichen, war es Aufgabe der vorliegenden Arbeit, H. acidophila für genetische Arbeiten zu erschließen und die Laccasegene zu isolieren.
Nach dem Nachweis extrazellulärer und zellassoziierter oxidativer Enzyme von H. acidophila, von denen zumindest die sezernierte Oxidase mit ihrer Kupferabhängigkeit und der Unfähigkeit Tyrosin zu oxidieren Eigenschaften einer Laccase besitzt, erfolgte ein Nachweis der Enzyme über laccasespezifische Antikörper. Die kompetitive Hemmung der Oxidasen durch Ascorbinsäure wies auf eine Beteiligung der Enzyme an der Melaninsynthese hin. Die Laccasegene wurden über Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Primern nachgewiesen, die von den konservierten Kupferbinderegionen abgeleitet worden waren. Es wurden vier Fragmente amplifiziert, die als Grundlage für eine inverse PCR dienten. Die Laccasegene lacc1 und lacc2 konnten so vollständig, lacc3 und lacc4 teilweise sequenziert werden.
Während das hypothetische Protein Lacc1 eine N-terminale Signalsequenz für den Proteinexport und 9 potenzielle N-Glykosylierungsstellen aufweist, besitzt Lacc2 keine Signalsequenz und nur 2 potenzielle N-Glykosylierungsstellen und ist deshalb mit großer Wahrscheinlichkeit in cytoplasmatischen, melanosomenartigen Organellen lokalisiert. Alle vier hypothetischen Proteine weisen sehr geringe Sequenzähnlichkeiten zu anderen Laccasen auf, und auch untereinander unterscheiden sich die Laccasen aus H. acidophila ungewöhnlich stark. Lacc1 und Lacc2 weisen einige Merkmale von Proteinen auf, die an ein saures Milieu angepasst sind, darunter vor allem eine deutliche Herabsetzung der Anzahl geladener Aminosäuren.
Mit diesen Ergebnissen sind die Grundlagen geschaffen, um die Laccasegene heterolog zu exprimieren. In Zukunft muss die Laccase mit den interessantesten Eigenschaften für den Einsatz in der Industrie bestimmt und das dazugehörige Gen für die Expression in einem geeigneten Expressionssystem vorbereitet werden.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/2338}
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