Beiträge zur Multielement-Speziation in pflanzlichen Lebensmitteln durch off-line-Kopplung von Gelpermeationschromatographie und Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma

Abstract

Das Resorptionsverhalten von Elementen im menschlichen Organismus wird entscheidend durch deren Bindungsformen beeinflusst. Außerdem existieren bei der Aufnahme aus der Nahrung zahlreiche Wechselwirkungen zwischen den Elementen. Zur ernährungsphysiologischen und toxikologischen Bewertung von Elementgehalten in Lebensmitteln ist deshalb eine Multielement-Speziation äußerst wichtig. Aufgrund dieser differenzierten Sichtweise sind Angaben über Bedarf, Grenzwerte und über das Verhalten von Elementen sinnvoll.<br /> Das Bindungsverhalten wurde von 42 Elementen in neun handelsüblichen pflanzlichen Lebensmitteln und Arabidopsis thaliana untersucht. Nach Ultra-Turrax-Behandlung und Zentrifugation der Homogenate wurde der Elementanteil im Überstand (Cytosol) und im Pellet durch Säureaufschluß/ICP-MS bestimmt. Bei 15 Elementen (Li, B, Rb, Mg, Ca, Ba, Sr, Fe, Mn, Co, Cu, Ni, Zn, Cd, Mo) konnten die Cytosol-Pellet-Verteilungen sicher quantifiziert werden (Anteile von über 50%, über 35% und zw. 25%-35 in Cytosol), bei restlichen Elementen war keine zufriedenstellende Quantifizierung möglich. Die erhaltenen Cytosole wurden anschließend durch GPC weiter aufgetrennt und die Elementgehalte in den einzelnen Fraktionen durch ICP-MS direkt bestimmt (GPC-ICP-MS-off-line-Kopplung). Hier konnten alle 15 o.g. Elemente in den erhaltenen GPC-Fraktionen quantifiziert werden, die jeweils mehrfach typische Elutionsverhalten aufwiesen. Interessant war, dass in Arabidopsis th. viele Elemente bei der GPC das gleiche Elutionsverhalten zeigten wie bei den pflanzlichen Lebensmitteln. Diese Pflanze kann somit vielfach als Modelsystem für die Element-Speziation in pflanzlichen Lebensmitteln dienen. <br /> Bei bekanntem Genom ist eine Identifizierung von vorliegenden Element-Proteinspezies mittels Methoden der Proteomics sehr gut möglich. Dies sollte am Beispiel der hochmolekularen 200 kDa Cd-Spezies (HM-Cd-SP) durchgeführt werden. Die HM-Cd-SP wurde in vielen hier untersuchten Cytosolen gefunden. Durch eine enzymatische Untersuchung wurde nachgewiesen, dass es sich bei der HM-Cd-SP um ein Protein handeln muss. Die HM-Cd-SP von Arabidopsis th. wurde durch (NH4)2SO4-Fällung, GPC, native PAGE und 2D-SDS-PAGE aufgetrennt, wobei nach Coomassie-Färbung ca. 40 Proteinspots resultierten. Bei der Untersuchung von 18 intensivsten Proteinspots mittels Trypsinverdau, MALDI-TOF-MS und Datenbankanalyse konnten mind. zwölf Proteinfragmente identifiziert werden. Sieben Fragmente aus den Rubisco-Protein-Untereinheiten (480 kDa), ein Fragment des LRR-Proteins (203 kDa), zwei Fragmente des AtATM-Proteins (440 kDa), das F1O19.10-Protein (50 kDa) und ein Protein unbekannter Funktion (12 kDa). Aus den hier erhaltenen Ergebnissen zeigte das LRR-Protein das nächste Molekulargewicht zu dem in GPC ermittelten Molekulargewicht der HM-Cd-SP von 200 kDa.

Contribution in multi element speciation in vegetables via off-line-coupling of gelpermeationchromatography and mass spectrometry with inductive coupled plasma<br /> The resorption behaviour of elements in human organism is critical affected by its binding forms. Diverse interactions among elements occurring throughout the uptake are explored in various cases. Therefore, multielement speciation is extremely important for the nutritional, physiological and toxicological assessment of element concentrations in foodstuffs. Specifications about demand, prescriptive limits and behaviour of elements are then reasonable if reviewed under these differentiated perceptions.<br /> Binding behaviours of 42 elements in nine commercially available vegetables and Arabidopsis thaliana have been examined in the study. After Ultra-Turrax treatment and centrifugation of the homogenates element concentrations in supernatant (cytosol) and in pellet have been determined via acid-digestion/ICP-MS. For 15 elements (Li, B, Rb, Mg, Ca, Ba, Sr, Fe, Mn, Co, Cu, Ni, Zn, Cd, Mo) cytosol-pellet-distribution of elements have been well quantified (rates over 50%, over 35% and 25%-35 in cytosol), while no satisfactory quantification was obtained for the remaining elements. The extracted cytosols were subsequently separated via GPC and the element concentration was directly measured in its individual fractions via ICP-MS (GPC-ICP-MS-off-line-coupling). All 15 elements have been quantified in the obtained GPC-fractions, whereas some typical elution behaviours appeared frequently. Notable result was that some elements in Arabidopsis cytosol showed similar elution behaviours in the GPC to the selected vegetable samples. Thus, the plant Arabidopsis thaliana can be considered as model system in many cases of the element speciation in vegetables.<br /> Furthermore, with known organism’s genom identification of element-protein-species can be carried out via proteomic methods. Since the enzymatic examination showed the protein character of the high molecular 200 kDa Cd-Species (HM-Cd-SP) in Arabidopsis cytosol, the applicability of proteomic methods was then exemplified on this HM-Cd-SP, which has been analogical found in some investigated cytosols. In this regard, Arabidopsis HM-Cd-SP was isolated and purified by (NH4)2SO4-precipitation, GPC, native PAGE and 2D-SDS-PAGE. The final gel staining by Coomassie technique resulted in approx.. 40 spots of proteins. Examination by trypsin digestion was then carried out for pre-selected 18 intensive stained spots, followed subsequently by MALDI-TOF-MS and database analyse. Candidates could be hereon issued for twelve protein fragments: seven fragments of the Rubisco-Protein-subunits (total of 480 kDa), one fragment of putative LRR-protein class (203 kDa), two fragments of AtATM-proteins (total 440 kDa), F1O19.10-protein (50 kDa) and one other protein with unknown function (12 kDa). Within the obtained results only the LRR-protein showed the closest molecular weight to the molecular weight of HM-Cd-SP computed previously in GPC as 200 kDa protein.