Biochemical and genetic analysis of the Sox multienzyme complex in the purple sulfur bacterium <i>Allochromatium vinosum</i>

Abstract

The best studied pathway of thiosulfate oxidation is the complete transformation to sulfate by a <i>sox</i> encoded periplasmic multienzyme complex. In the chemotroph <i>Paracoccus pantotrophus</i> Sox proteins are essential for thiosulfate and also for sulfide oxidation. Intermediates are not formed on the pathway to sulfate [1]. <br /> The purple sulfur bacterium <i>Allochromatium vinosum</i> oxidizes thiosulfate either to tetrathionate or to sulfate, dependent on pH. Intracellular sulfur globules occur as obligate intermediate of the latter pathway. Sequence analysis revealed the presence of five <i>sox</i> genes in two independent gene loci, <i>soxBXA</i> and <i>soxYZ</i>. The genes <i>soxCD</i>, encoding important proteins of the <i>P. pantotrophus</i> Sox complex, are not present in <i>A. vinosum</i>. <br /> Interposon mutagenesis of <i>soxB</i> and <i>soxX</i> in <i>A. vinosum</i> led to a complete inability of the cells to metabolize thiosulfate to sulfate while sulfide oxidation and tetrathionate formation remained uninhibited. Thiosulfate oxidation was also completely abolished in an <i>in frame</i> deletion mutant of <i>soxY</i>. Interestingly, this <i>soxY</i> mutation had further deleterious effects on sulfur compound oxidation: decomposition of sulfur globules formed during sulfide oxidation to sulfate was significantly slower and sulfite was excreted into the medium as an intermediate of this process. <i>A. vinosum</i> wild type is able to effectively use externally added sulfite as photosynthetic electron donor. Oxidation of external sulfite in the <i>soxY</i> mutant appeared greatly impaired, further demonstrating that the effects of a <i>soxY</i> mutation are not limited to thiosulfate oxidation. The observed phenotypes lead us to conclude that Sox proteins play a prominent role in <i>A. vinosum</i>. While SoxB and SoxXA are essential for thiosulfate oxidation, SoxY has an even more extensive function not only in thiosulfate oxidation but also in degradation of other sulfur compounds. In addition to the results obtained on a genetic basis, the work on protein level provided further proof for the actual presence of Sox proteins in <i>A. vinosum</i>. Three different proteins, encoded by the five <i>sox</i> genes present in <i>A. vinosum</i>, were purified from the organism. The first protein, SoxB, was isolated as a monomer. The second protein, SoxXA, was purified as a heterodimeric c-type cytochrome with both subunits containing a heme group. The third protein, the substrate binding molecule SoxYZ, was also present as a heterodimer in <i>A. vinosum</i>. <br /> [1] Friedrich, C.G. et al. (2001), Appl.Env.Microbiol.67: 2873-2882

<strong>Biochemische und genetische Analyse des Sox-Multienzym-Komplexes in dem Schwefelpurpurbakterium <i>Allochromatium vinosum</i></strong><br /> Der am besten untersuchte Weg der Thiosulfat-Oxidation ist die komplette Umsetzung zum Sulfat durch einen <i>sox</i>-Gen codierten, periplasmatischen Multienzym-Komplex. Im chemotrophen Bakterium <i>Paracoccus pantotrophus</i> sind Sox-Proteine essentiell für die Oxidation von Thiosulfat und Sulfid. Auf dem Weg zum Sulfat werden keine Intermediate gebildet [1]. <br /> Das Schwefelpurpurbakterium <i>Allochromatium vinosum</i> oxidiert in Abhängigkeit vom pH-Wert Thiosulfat entweder zu Tetrathionat oder zu Sulfat. Als obligates Intermediat auf dem Weg zum Sulfat werden intrazellulär Schwefelkugeln gebildet. Eine Gensequenz-Analyse zeigte die Anwesenheit von fünf <i>sox</i>-Genen (<i>soxBXA</i> und <i>soxYZ</i>), lokalisiert an zwei unabhängigen Positionen im Genom. Die Gene <i>soxCD</i>, die ein essentielles Protein des Sox-Komplexes von <i>P. pantotrophus</i> codieren, sind in <i>A. vinosum</i> nicht vorhanden.<br /> Die Interposon-Mutagenese von <i>soxB</i> und <i>soxX</i> führte zu einer kompletten Hemmung der Oxidation von Thiosulfat zu Sulfat, während Sulfidoxidation und Tetrathionatbildung unbeeinflußt blieben. Auch in einer <i>in frame</i>-Deletionsmutante von <i>soxY</i> zeigte sich eine vollständige Inhibition der Thiosulfatoxidation. Die Ausschaltung von <i>soxY</i> hatte noch weitere negative Effekte auf die Oxidation von Schwefelverbindungen: Schwefelkugeln, die während der Sulfidoxidation gebildet wurden, konnten nur signifikant verlangsamt abgebaut werden. Zusätzlich wurde Sulfit, als Intermediat des Oxidationsweges zum Sulfat, in das Medium ausgeschieden. Der <i>A. vinosum</i>-Wildtyp kann extern zugegebenes Sulfit effektiv als photosynthetischen Elektronendonor nutzen. Die Oxidation von extern zugegebenem Sulfit in der <i>soxY</i>-Mutante dagegen war deutlich beeinträchtigt. Die Auswirkungen der <i>soxY</i>-Deletion sind daher nicht auf die Oxidation von Thiosulfat beschränkt. Die beobachteten Phänotypen ließen den Schluß zu, dass Sox-Proteine eine wichtige Rolle in <i>A. vinosum</i> spielen. Während SoxB und SoxXA essentiell für die Thiosulfatoxidation sind, hat SoxY eine weitreichendere Funktion sowohl bei der Oxidation von Thiosulfat als auch beim Abbau anderer Schwefelverbindungen. Zusätzlich zu den Ergebnissen auf genetischer Basis lieferte die Arbeit auf Proteinebene Beweise für die tatsächliche Anwesenheit der Sox-Proteine in <i>A. vinosum</i>. Es konnten drei verschiedene Proteine aus dem Organismus isoliert werden, die von den fünf identifizierten <i>sox</i>-Genen codiert werden. Das erste Protein, SoxB, wurde als Monomer aufgereinigt. Das zweite Protein, SoxXA, wurde als heterodimeres c-Typ-Cytochrom identifiziert, wobei jede Untereinheit Träger einer Hämgruppe ist. Das dritte Protein, identifiziert als Substratbindemolekül SoxYZ, konnte ebenfalls als Heterodimer aus <i>A. vinosum</i> isoliert werden. <br /> [1] Friedrich, C.G. et al. (2001), Appl.Env.Microbiol.67: 2873-2882