Mänz, Barbara: Transkriptionelle Regulation der humanen Proteinkinase DYRK1A und Eigenschaften von DYRK1B-Spleißvarianten. - Bonn, 2007. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-10708
@phdthesis{handle:20.500.11811/3092,
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author = {{Barbara Mänz}},
title = {Transkriptionelle Regulation der humanen Proteinkinase DYRK1A und Eigenschaften von DYRK1B-Spleißvarianten},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2007,
note = {Der in Eukaryoten evolutionär konservierten und in Säugetieren ubiquitär exprimierten Proteinkinase DYRK1A (Dual-Specificity Tyrosine (Y) Phosphorylation-Regulated Kinase 1A) wird eine essentielle Bedeutung für Zellwachstum und -entwicklung zugeschrieben. Das menschliche DYRK1A-Gen ist in der "Down Syndrome Critical Region" auf Chromosom 21 (21q22.13) lokalisiert. Es wird vermutet, dass bereits die 1,5-fache Überexpression dieses Gens zum Down-Syndrom beiträgt. Da DYRK1A schon während ihrer Biosynthese an einem Tyrosinrest in der Aktivierungsschleife autophosphoryliert und daher möglicherweise konstitutiv aktiv ist, könnten Synthese und Abbau der DYRK1A-mRNA ihre Funktion beeinflussen.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Charakterisierung der humanen DYRK1A-Promotoren und die Regulation der DYRK1A-Expression.
In der 5´-Region des menschlichen DYRK1A-Gens wurden durch in silico-Analyse und durch eine Serie von Reportergen-Experimenten in drei Säugetier-Zelllinien zwei alternative Transkriptionsstarts und die zugehörigen Promotorbereiche identifiziert. Die Promotoren A und B sind nicht gewebsspezifisch aktiv, unterscheiden sich jedoch in ihrer Aktivität und Regulation: Promotor A war 3- bis 14-fach aktiver als Promotor B.
Der überexprimierte Transkriptionsfaktor E2F1 regulierte z. B. in SAOS-2-Zellen (humane Osteosarkom-Zelllinie) im Northern blot die DYRK1A-Expression ca. 1,6-fach hoch und stimulierte im Reportergen-Assay selektiv die Aktivität von Promotor B ca. 2,5-fach. E2F1 stimuliert während der G1/S-Phase des Zellzyklus die Expression von Genen, die für die Zellzykluskontrolle von Bedeutung sind, und kann bei einer DNA-Schädigung Apoptose auslösen.
In cDNA-Arrays wurde weder in Tumorzellen im Vergleich zu gesundem Gewebe, noch in 26 Tumorzelllinien eine systematisch veränderte DYRK1A-Expression nachgewiesen. 5-Fluorouracil (5-FU), das den Zellzyklus in der S-Phase anhielt, regulierte das in PC 3-Zellen (humane Prostataadenokarzinom-Zelllinie) bereits basal stark exprimierte DYRK1A-Gen im cDNA-Array hoch. Die beispielsweise in PC-3-Zellen im Northern blot nachgewiesene zeit- und dosisabhängige Hochregulation der DYRK1A-Expression durch 5-FU wurde nicht auf Promotorebene vermittelt.
An das in DYRK1A-Promotor A lokalisierte CRE (cyclic AMP Response Element)-Motiv band der u. a. für die neuronale Entwicklung bedeutsame Transkriptionsfaktor CREB in PC-12-Zellen (Phäochromozytom-Zelllinie der Ratte) zwar schwach, aber spezifisch (EMSA). Nach Forskolin-induzierter Aktivierung der Adenylatcyclase aktivierte CREB Promotor A jedoch nicht, auch nicht in PC-3- und SAOS-2-Zellen.
Serumentzug aktivierte in SAOS-2-Zellen Promotor A ca. 1,7-fach, Promotor B ca. 3-fach. Auch die im Western blot nachweisbare Zunahme der DYRK1A-Expression in NIH-3T3-Fibroblasten bei dreitägigem Entzug von Serum deutet darauf hin, dass DYRK1A auch in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren reguliert wird.
Mit Hilfe des Transkriptionsinhibitors Aktinomycin D wurde in PC-3-Zellen im Northern blot eine Halbwertszeit der DYRK1A-mRNA von nur ca. zwei Stunden ermittelt. Fehlte die ca. 2,3 Kilobasen umfassende 3´-Region der DYRK1A-mRNA, die sieben 5´-AUUUA-3´-Motive für schnellen Abbau der mRNA enthält, war die DYRK1A-mRNA länger als vier Stunden stabil.
Die in Hoden und Skelettmuskel von Säugetieren stark exprimierte, mit DYRK1A eng verwandte Proteinkinase DYRK1B wird mit der Differenzierung (G0-Phase des Zellzyklus) von Myoblasten und dem Überleben von Tumorzelllinien assoziiert.
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich die in höheren Eukaryoten Kinase-aktiven Spleißvarianten DYRK1B-p69 und -p75 von der Kinase-inaktiven Spleißvariante DYRK1B-p65 über die Kinase-Aktivität hinaus funktionell unterscheiden: die menschlichen Spleißvarianten DYRK1B-p69 und -p75 stimulierten in COS-Zellen (Niere der Afrikanischen Grünen Meerkatze) im Reportergen-Assay die vom Transkriptionsfaktor FKHR (Forkhead in Rhabdomyosarcoma) abhängige Aktivität des Glukose-6-Phosphatase-Promotors stärker als die menschliche DYRK1B-p65.
Stabil überexprimierte DYRK1B-p69 erhöhte im Vergleich zur endogenen DYRK1B weder unter serumhaltigen noch unter serumfreien Wachstumsbedingungen die Überlebensrate von NIH-3T3-Fibroblasten (WST-"Viabilitäts"-Assay).
Diese Arbeit charakterisiert erstmalig die Promotorregion des humanen DYRK1A-Gens und die Regulation der DYRK1A-Expression im Zellzyklus. Zudem werden Expression und Funktion von drei Spleißvarianten der Proteinkinase DYRK1B (p65, p69 und p75) näher untersucht.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/3092}
}

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