Transkriptionelle Regulation der humanen Proteinkinase DYRK1A und Eigenschaften von DYRK1B-Spleißvarianten

Abstract

Der in Eukaryoten evolutionär konservierten und in Säugetieren ubiquitär exprimierten Proteinkinase DYRK1A (<i><u>D</u>ual-Specificity Tyrosine (<u>Y</u>) Phosphorylation-<u>R</u>egulated <u>K</u>inase 1A</i>) wird eine essentielle Bedeutung für Zellwachstum und -entwicklung zugeschrieben. Das menschliche <i>DYRK1A</i>-Gen ist in der <i>"Down Syndrome Critical Region"</i> auf Chromosom 21 (21q22.13) lokalisiert. Es wird vermutet, dass bereits die 1,5-fache Überexpression dieses Gens zum Down-Syndrom beiträgt. Da DYRK1A schon während ihrer Biosynthese an einem Tyrosinrest in der Aktivierungsschleife autophosphoryliert und daher möglicherweise konstitutiv aktiv ist, könnten Synthese und Abbau der <i>DYRK1A</i>-mRNA ihre Funktion beeinflussen.<br /> Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Charakterisierung der humanen <i>DYRK1A</i>-Promotoren und die Regulation der <i>DYRK1A</i>-Expression.<br /> In der 5´-Region des menschlichen <i>DYRK1A</i>-Gens wurden durch <i>in silico</i>-Analyse und durch eine Serie von Reportergen-Experimenten in drei Säugetier-Zelllinien zwei alternative Transkriptionsstarts und die zugehörigen Promotorbereiche identifiziert. Die Promotoren A und B sind nicht gewebsspezifisch aktiv, unterscheiden sich jedoch in ihrer Aktivität und Regulation: Promotor A war 3- bis 14-fach aktiver als Promotor B.<br /> Der überexprimierte Transkriptionsfaktor E2F1 regulierte z. B. in SAOS-2-Zellen (humane Osteosarkom-Zelllinie) im <i>Northern blot</i> die <i>DYRK1A</i>-Expression ca. 1,6-fach hoch und stimulierte im Reportergen-<i>Assay</i> selektiv die Aktivität von Promotor B ca. 2,5-fach. E2F1 stimuliert während der G₁/S-Phase des Zellzyklus die Expression von Genen, die für die Zellzykluskontrolle von Bedeutung sind, und kann bei einer DNA-Schädigung Apoptose auslösen.<br /> In cDNA-<i>Arrays</i> wurde weder in Tumorzellen im Vergleich zu gesundem Gewebe, noch in 26 Tumorzelllinien eine systematisch veränderte <i>DYRK1A</i>-Expression nachgewiesen. 5-Fluorouracil (5-FU), das den Zellzyklus in der S-Phase anhielt, regulierte das in PC 3-Zellen (humane Prostataadenokarzinom-Zelllinie) bereits basal stark exprimierte <i>DYRK1A</i>-Gen im cDNA-<i>Array</i> hoch. Die beispielsweise in PC-3-Zellen im <i>Northern blot</i> nachgewiesene zeit- und dosisabhängige Hochregulation der <i>DYRK1A</i>-Expression durch 5-FU wurde nicht auf Promotorebene vermittelt.<br /> An das in <i>DYRK1A</i>-Promotor A lokalisierte CRE (<i><u>c</u>yclic AMP <u>R</u>esponse <u>E</u>lement</i>)-Motiv band der u. a. für die neuronale Entwicklung bedeutsame Transkriptionsfaktor CREB in PC-12-Zellen (Phäochromozytom-Zelllinie der Ratte) zwar schwach, aber spezifisch (EMSA). Nach Forskolin-induzierter Aktivierung der Adenylatcyclase aktivierte CREB Promotor A jedoch nicht, auch nicht in PC-3- und SAOS-2-Zellen.<br /> Serumentzug aktivierte in SAOS-2-Zellen Promotor A ca. 1,7-fach, Promotor B ca. 3-fach. Auch die im <i>Western blot</i> nachweisbare Zunahme der DYRK1A-Expression in NIH-3T3-Fibroblasten bei dreitägigem Entzug von Serum deutet darauf hin, dass <i>DYRK1A</i> auch in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren reguliert wird.<br /> Mit Hilfe des Transkriptionsinhibitors Aktinomycin D wurde in PC-3-Zellen im <i>Northern blot</i> eine Halbwertszeit der <i>DYRK1A</i>-mRNA von nur ca. zwei Stunden ermittelt. Fehlte die ca. 2,3 Kilobasen umfassende 3´-Region der <i>DYRK1A</i>-mRNA, die sieben 5´-AUUUA-3´-Motive für schnellen Abbau der mRNA enthält, war die <i>DYRK1A</i>-mRNA länger als vier Stunden stabil.<br /> Die in Hoden und Skelettmuskel von Säugetieren stark exprimierte, mit DYRK1A eng verwandte Proteinkinase DYRK1B wird mit der Differenzierung (G₀-Phase des Zellzyklus) von Myoblasten und dem Überleben von Tumorzelllinien assoziiert.<br /> In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich die in höheren Eukaryoten Kinase-aktiven Spleißvarianten DYRK1B-p69 und -p75 von der Kinase-inaktiven Spleißvariante DYRK1B-p65 über die Kinase-Aktivität hinaus funktionell unterscheiden: die menschlichen Spleißvarianten DYRK1B-p69 und -p75 stimulierten in COS-Zellen (Niere der Afrikanischen Grünen Meerkatze) im Reportergen-<i>Assay</i> die vom Transkriptionsfaktor FKHR (<i><u>F</u>or<u>kh</u>ead in <u>R</u>habdomyosarcoma</i>) abhängige Aktivität des Glukose-6-Phosphatase-Promotors stärker als die menschliche DYRK1B-p65.<br /> Stabil überexprimierte DYRK1B-p69 erhöhte im Vergleich zur endogenen DYRK1B weder unter serumhaltigen noch unter serumfreien Wachstumsbedingungen die Überlebensrate von NIH-3T3-Fibroblasten (WST-"Viabilitäts"-<i>Assay</i>).<br /> Diese Arbeit charakterisiert erstmalig die Promotorregion des humanen <i>DYRK1A</i>-Gens und die Regulation der <i>DYRK1A</i>-Expression im Zellzyklus. Zudem werden Expression und Funktion von drei Spleißvarianten der Proteinkinase DYRK1B (p65, p69 und p75) näher untersucht.