Zimmermann, Katrin: Expression und Untersuchung von Enzymen der Pederin-Biosynthese aus einem nicht kultivierten Symbionten. - Bonn, 2008. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-15457
@phdthesis{handle:20.500.11811/3688,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5N-15457,
author = {{Katrin Zimmermann}},
title = {Expression und Untersuchung von Enzymen der Pederin-Biosynthese aus einem nicht kultivierten Symbionten},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2008,
note = {Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Enzymen des ped-Genclusters aus einem bisher nicht kultivierten Symbionten.
Der ped-Cluster gehört zu Typ-I-Polyketidsynthasen (PKS), in denen die Acyltrans-ferasen (AT) in trans agieren. Die PKS ist modular aufgebaut, wobei jedes Modul in Domänen untergliedert ist. Zwei Module bestehen aus Nichtribosomalen Peptid-synthetasen (NRPS). Dem Cluster wird die Herstellung von Pederin zugeschrieben, eine sehr wirksame Antitumorsubstanz, die in Käfern der Gattung Paederus und Paederidus gefunden werden kann. Die eigentliche Biosynthese von Pederin wird wahrscheinlich durch einen in den Käfern lebenden bakteriellen Symbionten durchgeführt, der ein naher Verwandter von Pseudomonas aeruginosa ist.
Für genauere Hinweise auf die Funktionen einzelner Enzyme während der Pederin-Biosynthese wurden verschiedene Gene des putativen Genclusters kloniert und exprimiert. Die aufgereinigten Proteine konnten anschließend in Enzym-Assays eingesetzt werden. Hauptaspekt der Arbeit waren dabei zum einen die AT und Acylcarrierproteine (ACP) und zum anderen die O-Methyltransferasen (O-MT). Dabei sollten Substrat- und ACP-Spezifität der AT und die Regioselektivität der O-MT näher beleuchtet werden.
Von den untersuchten ACP wurde PedN, codiert als separates Gen, und PedI3, eine Doppel-ACP innerhalb eines Moduls, erfolgreich als His8-Fusionsprotein exprimiert. Die Umsetzung vom apo- zum aktiven holo-ACP gelang durch die Verwendung von Svp, eine Phosphopantetheinyltransferase aus Streptomyces verticillus ATCC15003. Die Bestätigung der erfolgten Phosphopantetheinylierung erfolgte durch MALDI-TOF- bzw. ESI-FT-ICR-MS. Die beiden vorhandenen AT PedC und PedD konnten als MBP- bzw. His8-Fusionsprotein hergestellt werden. Eine Expression von PedC mit N-terminalen His8 brachte nur unlösliches Protein hervor. Zur Untersuchung der ACP-AT-Assays konnte die Verwendung von radioaktiv markierten Substraten als geeignete Methode herausgestellt werden. Dabei zeigte sich, dass PedD in der Lage ist, Malonyl-CoA zu übertragen, während es Acetyl-CoA nicht als Substrat nutzen kann. Der Transfer von Malonyl-CoA erfolgt dabei sowohl auf PedN als auch auf PedI3. Die AT weist demnach eine Substrat- jedoch keine ACP-Spezifität auf. PedC zeigte weder gegenüber Malonyl- noch Acetyl-CoA Aktivität und ist nach bisherigen Daten nicht in der Lage, das Substrat auf die ACP zu übertragen. Am Ende wurde auch die GCN5-verwandte N-Acetyltransferase (GNAT) mit dem darauffolgenden ACP kloniert und als His8-Fusionsprotein exprimiert. Bei der GNAT könnte es sich um den Überträger des Startersubstrates Acetyl-CoA handeln. Kinetische Untersuchungen des Transfers von Malonyl-CoA auf PedN durch PedD wurden begonnen. Die Durchführung dieser Untersuchung muss jedoch noch optimiert werden, um die entsprechenden Parameter kcat und Km zu ermitteln.
Da Pederin vier Methoxygruppen, der ped-Cluster aber nur die drei O-MT PedA, PedE und PedO enthält, sollten diese untersucht werden. Sie wurden jeweils als MBP- und His8-Fusionsprotein erfolgreich exprimiert. Als Substratanaloga dienten Mycalamid A und B aus dem Schwamm Mycale hentscheli, die weniger O-Methylierungen als Pederin aufweisen, ihm strukturell aber sehr ähneln. Die Enzym-Assays von Fusionsprotein, Substrat und S-Adenosylmethionin (SAM) als Kofaktor wurden mittels ESI-micrOQ-TOF-MS analysiert. Dabei zeigte sich, dass PedO in der Lage ist, eine Hydroxylgruppe in Mycalamid A zu methylieren. MS/MS-Versuche stellten heraus, dass es sich um die Methylierung der OH-Gruppe an C17 oder C18 handeln muss. Die Derivatisierung des Reaktionsproduktes sowie LC-MS brachten keine spezifischeren Aussagen. Die Analyse des Reaktionsproduktes aus PedO und Mycalamid A mittels 1D- und 2D-NMR lieferte aber das Ergebnis, dass es sich um 18-O-Methylmycalamid A handeln muss. Diese durch PedO erzeugte Substanz ist nicht als Naturstoff bekannt und stellt ein neues Mitglied der Mycalamide dar. Damit wurde der erste funktionelle Beweis erbracht, dass der ped-Gencluster für die Biosynthese von Pederin verantwortlich ist.
OnnD, eine O-MT aus dem onn-Gencluster (putativer Cluster der Biosynthese von Onnamid A aus Theonella swinhoei) wurde erfolgreich als MBP-Fusionsprotein exprimiert. Der entsprechende Enzym-Assay mit Pederin als Substrat zeigte keine O-Methylierung. Demnach scheint OnnD nicht für die Methoxygruppe an C13 zuständig zu sein, oder Pederin wird als Strukturanaloga nicht akzeptiert.
Für zukünftige Versuche wurden die Oxidoreduktase PedB, die beiden A-Domänen, die Ketosynthase PedM und die HMGCoA-Synthase PedP als MBP- und teilweise als His8-Fusionsprotein erfolgreich exprimiert. Die beiden letztgenannten Enzyme sind wahrscheinlich an der Bildung der Exomethylengruppe an C4 in Pederin beteiligt. Die A-Domänen sind Bestandteile der NRPS und für die Auswahl und Aktivierung der jeweils einzubauenden Aminosäure erforderlich.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/3688}
}

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