Development of Methods for Solid Phase Synthesis of Polyamine Conjugates and Initial Biological Evaluation of Their Potential to Enhance Cellular Uptake

Abstract

Cationic peptides have shown their potency to efficiently enhance cellular uptake of covalently coupled molecules. In order to avoid their rapid degradation by peptidases, diverse classes of peptide mimics like peptoids, β-peptides, and oligocarbamates were exploited. Polyamines, although bearing high density of positive charges at physiological pH, found only less regard for the purpose to act as covalently coupled drug delivery agents. <br /> To solve problems, which occurred during the synthesis of polyamines, a solid phase strategy was developed, which especially allows the generation of acid sensitive polyamine-conjugates. On the strongly acid labile trityl linkers, which allow the mild cleavage from the resin, the Aloc group was introduced into polyamine chemistry, to serve for the permanent protection of the backbone amines. Fukuyama alkylation was identified as the method of choice for backbone elongation. Compatibility with the protection group strategy was demonstrated and the reaction conditions were optimised. Finally, Fukuyama alkylation allowed the introduction of a variety of functional groups, which could not be used with other frequently used alkylation methods. The combination of trityl linker and Aloc-, o-Nosyl-, and Dde-protection groups allowed branching by introduction of side chains on particular amines of the backbone. For this, Reductive amination turned out to be the appropriate alkylation method. For the bioconjugation of polyamines, the Michael addition of thiols to maleimides was exploited, which already showed its utility to couple large molecules like oligonucleotides and peptides. After introduction of a maleimide to an immobilised polyamine, its reaction with different sulfides was investigated. It showed suitability to efficiently couple diverse sulfides of medium polarity on polystyrene resins. The vice versa strategy, integration of a thiol on the immobilised polyamine and coupling with maleimides was also investigated. The coupling with 2 iminothiolane showed to be superior to all other examined methods. An alkoxytrityl resins with even higher acid sensitivity than most commercially available resins, was prepared. On this resin, coupling with 2-iminothiolane allows the quick generation of polyamine conjugates under very mild conditions. The selectivity of 2-iminothiolane for primary amines supersedes the use of complex protection schemes. The synthetic methods were used to generate a variety of polyamine conjugates with nucleosides, fluorophores, porphyrin, Indomethacin, and a radical scavenger. Evaluation of some of these conjugates by fluorescence microscopy showed enhanced cellular uptake. Intensive investigation on the amphiphilic polyamine-porphyrin conjugate showed a mitochondrial localisation. Irradiation caused severe cell damage. Co-cultures of mammalian cells with tumour cells or bacteria, respectively, showed a beneficial differentiation between those cell types. As the uptake into tumour cells was faster than into bacteria, which was again faster than that into mammalian cells, the compound is a candidate for application in photodynamic therapy. Toxicological data for most of the tested compounds were determined by the MTT assay.

<strong>Entwicklung von Methoden zur Festphasensynthese von Polyamin-Konjugaten und initielle biologische Untersuchung von deren Potential zur Verstärkung der zellulären Aufnahme</strong><br /> Kationische Peptide haben ihre Potenzial bewiesen, die zelluläre Aufnahmen kovalent gebundener Moleküle zu verbessern. Um ihren schnellen Abbau durch Peptidasen zu verhindern wurden unterschiedliche Klassen von Peptidmimetika, wie Peptoide, β-Peptide, and Oligocarbamate untersucht. Polyamine, welcher ebenfalls eine hohe Dichte an positiven Ladungen bei physiologischem pH-Wert tragen, wurden bereits für die Komplexierung negativ geladener Moleküle wie beispielsweise DNA verwendet. Allerdings fanden sie zum jetzigen Zeitpunkt kaum Beachtung als kovalent gebundener Transporter für die zelluläre Aufnahme von Wirkstoffen. <br /> Um die Probleme zu lösen, die im Laufe der Polyaminsynthese gewöhnlich auftreten, wurde eine festphasengebundene Synthesestrategie entwickelt, die vor allem der Darstellung empfindlicher Polyaminkonjugate dienen soll. Während stark säurelabile Trityllinker eine milde Abspaltung erlauben, wurde die Alloc-Gruppe, welche als permanente Schutzgruppe für die Amine des Rückgrades fungiert, in die Polyaminchemie eingeführt. Fukuyama Alkylierung wurde als Methode der Wahl für die Verlängerung des Rückgrades identifiziert. Die Kompatibilität mit der gewählten Schutzgruppenstrategie wurde gezeigt und die Reaktionsbedingungen optimiert. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Fukuyama Alkylierung die Einführung unterschiedlicher funktioneller Gruppen erlaubt, deren Verwendung bei anderen Alkylierungsmethoden nicht möglich wäre. Die Kombination von orthogonalem Trityl-Linker, Aloc-, o-Nosyl- und Dde-Schutzgruppe erlaubte Verzweigung durch selektive Einführung von Seitenketten an bestimmten Aminen des Rückgrades. Hierbei zeigte sich Reduktive Aminierung als probate Alkylierungsmethode. <br /> Für die Biokonjugation von Polyaminen wurde die Michael-Addition von Thiolen an Maleimide gewählt, welche bereits ihre Verwendbarkeit für die Kupplung großer Moleküle wie Oligonucleotide und Peptide gezeigt hat. Nach Bindung eines Maleimides an das immobilisierte Polyamin wurde dessen Reaktion mit Sulfiden untersucht. Es zeigte sich, dass die Reaktion geeignet ist, Sulfide mittlerer Polarität an Polystorenharzen zu kuppeln. Die umgekehrte Strategie, Einführung eines Thiols an ein immobilisiertes Polyamin und Bindung an Maleimide wurde ebenfalls untersucht. Kupplung mit 2-Iminothiolan zeigte sich gegenüber allen anderen untersuchten Methoden als überlegen. Ein Alkoxytritylharz mit hoher Säurelabilität wurde hergestellt. An diesem Harz erlaubte die Kupplung mit 2-Iminothiolan eine schnelle Darstellung von Polyaminkonjugaten unter sehr milden Bedingungen durchzuführen. Die Selektivität von 2-Iminothiolan für primäre Amine macht die Verwendung von komplexen Schutzgruppen-Schemata überflüssig. Diese synthetischen Methoden wurden verwendet um Polyaminkonjugate mit Nucleosiden, Fluorophoren, Porphyrin, Indomethacin und einem großen aromatischen Radikalfänger darzustellen. Untersuchung einiger dieser Konjugate durch Fluoreszenzmikroskopie zeigte verstärkte zelluläre Aufnahme. Intensive Untersuchung des amphiphilen Polyamin-Porphyrinkonjugates in Fibroblasten, HeLa-, HepG2- und COS7-Zellen zeigte dessen mitochondriale Lokalisierung. Bestrahlung verursachte schwerewiegende Zerstörung der Zellen. Co-Kulturen von Säugetierzellen und Tumorzellen bzw. Bakterien zeigten eine vorteilhafte Differenzierung zwischen diesen Zelltypen. Da die Aufnahme in Tumorzellen stärker war als die in Bakterien und diese wiederum stärker als die in Säugerzellen, ist die Verbindung ein Kandidat für den Einsatz in der photodynamischen Therapie. Die toxokologischen Daten der meisten dargestellten Polyaminkonjugate wurden mit dem MTT-Test bestimmt.