Distribution and molecular characterization of aflatoxin-producing and nonproducing isolates of Aspergillus section Flavi for biological control of aflatoxin contamination in maize in Nigeria

Abstract

Fungal communities in soils of Nigerian maize fields were examined to determine distributions of aflatoxin-producing fungi and to identify endemic atoxigenic strains of potential value as biological control agents for limiting aflatoxin contamination in West African crops. Over 1,000 isolates belonging to Aspergillus section Flavi were collected from soil of 55 Nigerian maize fields located in three agroecological zones by dilution plating onto modified Rose Bengal agar. The most common member of Aspergillus section Flavi (85% of isolates) was the A. flavus L-strain followed by the unnamed taxon known as strain SBG (8%), A. tamarii (6%) and A. parasiticus (1%). The highest incidence of SBG was in the Zaria district, and the lowest was in the Ogbomosho and Ado-Ekiti districts. Only 44% of 492 A. flavus isolates produced aflatoxins (limit of detection 5 ng g^-1). All SBG and A. parasiticus isolates produced both B and G aflatoxins and greater than 300 µg g^-1 total aflatoxins. Thirty two percent of the A. flavus isolates produced >1 µg g^-1 total aflatoxins but no A. flavus isolate produced G aflatoxins. The most important aflatoxin producers varied by region. However, all regions had atoxigenic strains of potential value as biological control agents.<br /> In addition, this study focused on 18 atoxigenic A. flavus Vegetative Compatibility Groups (VCGs) collected from naturally infected maize. Loci across the 68 kb aflatoxin biosynthesis gene cluster were compared among the 18 atoxigenic VCGs, an atoxigenic strain used commercially in North America to manage aflatoxins, and several aflatoxin producers. Five of the VCGs from Nigeria had large deletions (37kb to 65kb) extending from the telomeric side of the aflatoxin biosynthesis cluster. In one case (isolate AV0222), the deletion extended through the cluster to the adjacent sugar cluster. The remaining 12 atoxigenic VCGs, including the VCG used for aflatoxin management in North America contained all genes of the aflatoxin pathway. Comparison of pathway genes revealed more changes in atoxigenic than in aflatoxin-producing VCGs and several non-synonymous changes that are unique to atoxigenics. However, for some atoxigenic VCGs, additional sequencing and experimentation will be required to determine precise causes of atoxigenicity.<br /> Finally, a set of atoxigenic and toxigenic A. flavus L-strains from each soil sample were analyzed to determine their morphological, physiological, and genetic characters. Isolates that produced high levels of toxin in liquid fermentation produced proportionally less spores and had a higher sclerotia mass on Czapeks agar (31°C, 25days), while isolates with high spore mass and less sclerotia mass produced less aflatoxin. Portions of the aflatoxin biosynthetic pathway genes, aflR, as well as genes from the Aspergillus flavus genome (taka amylase and pecA) were amplified by PCR and sequenced. Phylogenetic analysis of all three genes confirmed that the high B+G aflatoxin producing SBG strain of West Africa did not belong to A. minisclerotigenes or Group II as previously assumed. A. parasiticus isolates of Nigeria were phylogenetically separated from those of other regions in the world. Within the A. flavus isolates, differences between toxigenic and atoxigenic L-strains were found in two of three analyzed genes.

<strong>Die Verteilung und molekulare Charaterisierung von aflatoxin produzierenden und nicht-produzierenden Aspergillus Isolaten für die Entwicklung einer biologischen Bekämpfungsmassnahme von aflatoxin kontaminierten Mais in Nigeria</strong><br /> Die Verteilung von aflatoxinbildenden und nicht-aflatoxinbildende Aspergillus Stämmen aus nigerianischen Böden wurde bestimmt mit dem Ziel mögliche natürlich vorkommende nicht-aflatoxinbildenden Aspergillus Isolate als biologische Kontrolmaßnahme verwenden zu können. Aus insgesamt 55 Bodenproben nigerianischer Maisfelder, die über 3 agroecologische Zonen verteilt waren, wurden über 1000 Aspergillus Isolate auf Rose Bengal Agar isoliert. Der am häufigsten vorkommende Vertreter der Gattung Aspergillus war A. flavus L-Stamm (85%), gefolgt von dem namenlosen Taxon, bekannt als SBG-Stamm (8%), A. tamarii (6%) und A. parasiticus (1%). Das höchste Aufkommen von SBG Isolaten wurde im Bezirk Zaria ermittelt und das niedrigste in den Bezirken Ogobomosho und Ado-Ekiti. Nur 44% von 492 A. flavus Isolaten produzierten Aflatoxin bei einer Nachweisgrenze von 5 ng g^-1. Alle SBG Isolate sowie A. parasiticus Isolate produzierten B- und G-Aflatoxine mit mehr als 300 µg g^-1 total Aflatoxin. Von den A. flavus Isolaten produzierten 32% mehr als 1 µg g^-1 total Aflatoxin und keiner der A. flavus Isolaten produzierte G-Aflatoxine. In allen Regionen wurden nicht-aflatoxinbildende Aspergillus Stämme gefunden. Diese A. flavus Isolate wurden auf ihre Tauglichkeit als biologische Kontrollmaßnahme weiter untersucht. <br /> Desweiteren wurden 18 von Mais isolierte nicht-aflatoxinbildende A. flavus Vegetative Compatibility Groups (VCGs) untersucht. Verschiedene Genabschnitte von dem 68 kb grossen Gencluster des aflatoxin Biosyntheseweges wurden mit den 18 nicht-aflatoxinbildenden VCGs, einem gewerblich genutzten nicht-aflatoxinbildenden Stamm aus Nord Amerika und mehreren aflatoxinbildenden Stämmen verglichen. Von der telomerischen Seite ausgehend zeigten fünf VCGs fehlende Genabschnitte im Gencluster des aflatoxin Biosynthesewege von der Grösse von 37 bis 65kb. Dem Isolat AV0222 fehlte das komplette Gencluster des aflatoxin Biosyntheseweges bis zum angrenzenden Zuckergencluster. Für die restlichen nicht-aflatoxinbildenden VCGs, sowie das nicht-aflatoxinbildenden Isolat aus Nord Amerika wurden alle Gene des aflatoxin Biosyntheseweges nachgewiesen. Der direkte Vergleich der Genesequencen zeigte mehr Punktmutationen in nicht-aflatoxinbildenden Isolaten als in aflatoxinbildenden Isolaten, die zum Teil eine Änderung der Aminosäure zur Folge hatte. Mehr Forschungsarbeit ist notwendig, um zu ermitteln, warum einige Aspergillus Stämme kein Aflatoxin synthetisierten.<br /> Letztendlich wurden nicht-aflatoxinbildende und aflatoxinbildende A. flavus L-Stämme auf deren morphologischen, physiologischen und genetischen Charateristika untersucht. Isolate, die in Flüssigfermentation einen hohen Anteil an Aflatoxin produzierten, zeigten proportional weniger Sporenwachstum und hatten ein höheres Sclerotiagewicht auf Czapeks Agar (31°C, 25 Tage). Hingegen produzierten Isolate mit hohem Sporenwachstum und niedrigem Sclerotiagewicht, weniger Aflatoxin. Genabschnitte des aflatoxin Biosyntheseweges aflR, sowie Gene des Aspergillus Genome (Taka Amylase und PecA) von verschiedenen Aspergillus Isolaten aus Nigeria und Weltweit wurden mittels PCR amplifiziert und sequenziert. Die phylogenetische Analyse von allen Genabschnitten bestätigte, dass anders als vorher angenommen, der B+G aflatoxinbildende SBG-Stamm aus West Afrika weder der Art A. minisclerotigenes noch der Group II angehört. A. parasiticus Isolate Nigerias unterschieden sich phylogenetisch von denen aus anderen Regionen der Welt. Aflatoxinbildende und nicht-aflatoxinbildende A. flavus Isolate unterschieden sich phylogenetisch in zwei von drei analysierten Genen.