Bewertung von pharmakokinetischen Parametern zur Phänotypisierung des menschlichen Cytochrom P450 Enzyms CYP2D6 mittels Dextromethorphan

Abstract

Der Umsatz von Dextromethorphan (DEX) zu dessen CYP2D6 abhängig gebildeten Metaboliten Dextrorphan (DOR) wird seit langer Zeit für die CYP2D6 Phänotypisierung verwendet, jedoch fehlt es bislang an einer systematischen Validierung der hierfür einsetzbaren Phänotypisierungsparameter. Daher war das Ziel dieser Dissertation die Evaluierung von 48 möglichen Parametern in Urin und Plasma anhand definierter Validierungskriterien.<br /> Für diese Arbeit wurden 84 Probanden und Patienten in fünf Cocktail-Interaktionsstudien je zweimal mit DEX phänotypisiert. Zur Analyse der hierbei gewonnenen Plasma- und Urinproben wurde eine robuste, sensitive und selektive LC-MS/MS Methode entwickelt und validiert. Die Proben wurden jeweils mit und ohne Spaltung der DOR-Glucuronide vermessen, um beide Verfahren bezüglich ihrer Eignung zu vergleichen. Die Validierung aller Parameter erfolgte zunächst durch Berechnung der jeweiligen inter- und intraindividuellen Variationskoeffizienten (CV inter/intra) sowie durch Korrelation mit Vergleichsparametern, welche die CYP2D6 Aktivität zuverlässig widerspiegeln. Zur Verifizierung der Phänotypisierungsdaten wurden 48 Probanden auf 26 verschiedene CYP2D6 Allele hin genotypisiert und entsprechend der dem Genotyp nach zu erwartenden Enzymaktivität in ein activity-score System (AS) eingeteilt. Der Zusammenhang zwischen Genotyp-AS und Phänotyp wurde graphisch und mittels einfaktorieller ANOVA rechnerisch überprüft. Für viel versprechende Parameter erfolgte eine weitere Validierung durch lineare Regression zwischen Genotyp-AS und Phänotyp und durch getrennt nach Genotyp-AS durchgeführte Berechnung des CV intra. Zur besseren Vergleichbarkeit der Ergebnisse wurde ein Punkte-Scoringsystem entwickelt, anhand dessen die Validierungsergebnisse für alle Parameter in vergleichbare Zahlenwerte überführt werden konnten.<br /> Bestimmungen in Urin ergaben insgesamt höhere CV intra Ergebnisse und schlechtere Zusammenhänge zwischen Genotyp-AS und Phänotyp, zudem spielt hier als Fehlerquelle der Urin pH hinein, was durch lineare Regression der DEX-/DOR-Clearance mit dem Urin pH nachgewiesen wurde. Die Methode der Deglucuronidierung ergab für Messungen in Plasma und Urin weniger Scoringpunkte im Vergleich zu nicht behandelten Proben. Hier erzielten die Plasmaproben zwischen 2 h und 4h15 die besten Scoringergebnisse, zunächst in den grundlegenden Validierungsschritten und ebenso in den zusätzlichen beiden Schritten. Somit ergibt sich ein klarer Vorteil einer Phänotypisierung mit Plasmaparametern, wobei das metabolische Verhältnis in 3h15 Plasma die höchste Scoring-Punktzahl erzielte, so dass sich dieser Parameter als validestes Maß für die CYP2D6 Phänotypisierung feststellen lässt.

<b>Evaluation of pharmacokinetic metrics for phenotyping of the human CYP2D6 enzyme with dextromethorphan</b><br /> The conversion of dextromethorphan (DEX) to its CYP2D6 mediated metabolite dextrorphan (DOR) has been used for CYP2D6 phenotyping for decades, however, the utability of the different possible phenotyping tools needs further validation. In this work 48 different phenotyping metrics in urine and plasma were validated systematically according to pre-defined validation criteria. <br /> 84 subjects, who took part in five cocktail-interaction trials, were phenotyped with DEX twice. For the analytics of the thereby obtained plasma and urine samples a robust, sensitive, and selective LC MS/MS method was developed and validated first. The samples were analysed first with and then without cleavage of the DOR-glucuronides respectively. Validation of each possible phenotyping-metric was carried out by calculation of inter- and intraindividual coefficients of variation (CV inter/intra). Furthermore, correlations of all metrics with comparative parameters, which are known to exactly reflect CYP2D6 activity, were evaluated. The phenotying results were verified by vast genotyping experiments including 26 CYP2D6 alleles for 48 subjects, and the obtained data were then classified to seven activity-score (AS) sub-groups according to the enzymatic activity expected from the genotyping data. The relations between genotype-AS and phenotype were examined by graphical plots and by one-way ANOVA. The most promising metrics were additionally validated by linear regression between AS-groups and phenotyping results as well as by separate calculation of inter- and intraindividual coefficients of variation for each AS-group. To allow better comparability of all evaluated metrics, the validation results were converted into numerical values according to a scoring-system. <br /> Urine phenotyping gave higher CV intra results and worse relations between genotype-AS and phenotype. Additionally, measurements in urine are influenced by urine-pH, which was proved by linear regression between drug clearance and pH for both analytes. Glucuronide-cleavage gave worse scoring-results for both plasma and urine phenotyping in comparison to untreated samples. Regarding the plasma metrics without deglucuronidation the best accordance with all validation criteria was reached for samples taken between 2 h and 4h15. This was first shown by the basic four validation steps and was then confirmed by two additional steps. A clear advantage of plasma-phenotyping was revealed, while the metabolic ratio DEX/DOR of the 3h15 sample attained the highest scoring-results in particular. Thus, this phenotyping metric is designated the most appropriate tool for CYP2D6 phenotyping according to the thorough validation carried out in this work.