Funktionelle und molekulare Untersuchungen zur Expression von GABA_A- und P2_X-Rezeptoren in Gliazellen des Hippocampus

Abstract

In dieser Arbeit wurden Membranrezeptoren von Gliazellen des Hippocampus funktionell und molekular untersucht.<br /> Der Fokus der Untersuchungen lag auf der Charakterisierung der GABA_A-Rezeptoren in GluR-Zellen. Grundlage der Untersuchung war ein transgenes Tiermodell, in dem hGFAP-Promotoraktivität die Expression von EGFP steuert und sowohl GluR- als auch GluT-Zellen markiert. Ein weiteres Ziel war der Nachweis von funktionellen P2X-Rezeptoren in Gliazellen des Hippocampus. Hierfür wurden zusätzlich Ratten und humane Resektate untersucht. <br /> Die Untersuchungen an GluR-Zellen aus dem Hippocampus ergaben, dass diese GABA_A-Rezeptoren exprimieren, die sich von denen der Neurone unterscheiden. So zeigten akut isolierte Zellen Rezeptorantworten auf GABA mit einer langsameren Desensitisierung als sie in Neuronen beobachtet wurden. Auch zeigten sich in akuten Schnitten eine niedrigere Rezeptordichte sowie eine geringere Affinität für GABA. Im Vergleich zu Astrozyten und Müllerzellen besitzen GluR-Zellen jedoch eine höhere Rezeptordichte. <br /> Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass GluR-Zellen eine hohe native intrazelluläre [Cl-] aufweisen. Die Aktivierung von GABA_A-Rezeptoren führt somit zur Depolarisation der Zelle. Dadurch könnte - wie in jungen Neuronen - eine Aktivierung von spannungsabhängigen Ca²⁺-Kanälen sowie von NMDA-Rezeptoren ausgelöst werden. <br /> Durch die pharmakologische Charakterisierung der GABA_A-Rezeptorantworten sowie die Analyse der Transkripte einzelner Untereinheiten konnte die mögliche Rezeptor-Zusammensetzung ermittelt werden. GABA_A-Rezeptoren aus α_1,2,3β_2,3γ2 Untereinheiten-Kombinationen vermitteln den Großteil der GABA-induzierten phasischen Ströme in GluR-Zellen. Diese Kombinationen werden auch in Neuronen vorgefunden, daher sind posttranslationale Modifikationen die wahrscheinliche Ursache für die geringere Affinität der Rezeptoren in GluR-Zellen. <br /> Bei GluR-Zellen traten neben phasischen Strömen auch persistierende tonische Ströme auf, die in Neuronen durch perisynaptische Rezeptoren vermittelt werden. Die Analyse der RNA Transkripte ergab Unterschiede zur Zusammensetzung der Rezeptoren, die in Neuronen tonische Ströme vermitteln.<br /> Weiterhin wurden in dieser Arbeit hippocampales Gewebe von Mäusen, Ratten und humanen Resektaten auf P2X Rezeptoren untersucht. Es konnten keine funktionellen P2X-Rezeptoren in hippocampalen GluR- und GluT-Zellen nachgewiesen werden. Weder schnelle Applikation von ATP durch Photolyse noch spezifische Rezeptoragonisten konnten Ströme auslösen. Zusätzliche Untersuchungen an P2X₇-Knockout-Mäusen zeigten, dass langsame ATP vermittelte Antworten auf indirekte Effekte zurückzuführen sind. Die in Publikationen propagierte Hypothese, dass Gliazellen nach Aktivierung ionotroper P2X-Rezeptoren Glutamat ausschütten, konnte demnach für hippocampalen GluR- und GluT-Zellen nicht bestätigt werden.

This thesis covered the functional and molecular analysis of membrane receptors on glial cells. The focus of the study was on the characterization of GABA_A receptors in GluR cells. Tests were done in a transgenic mouse line with hGFAP promoter-controlled EGFP expression. Both GluR and GluT cells were labeled in the hippocampus. Another goal was to provide proof of functional P2X receptors in the hippocampus of mice rats and human tissue. This study revealed that GluR cells express GABA_A receptors, which differ from the ones in neurons. Acutely isolated cells displayed receptor currents with slower desensitization time constant than it was shown for neurons. Additionally a lower receptor density as well as a reduced affinity for GABA compared to neurons was observed in acute slices. But GluR cells posses a higher receptor density than astrocytes or Muller cells. Furthermore we could detect a high native [Cl-] in GluR cells. Therefore activation of GABA_A receptors leads to depolarization of these cells. This could trigger activation on voltage gated Ca²⁺ channels and NMDA receptors as described for immature neurons in the developing brain. GABAA receptor formation was analyzed via pharmacological characterization of receptor currents and analysis of subunit transcripts. It appeared that GABA_A receptors consisting of α_1,2,3β_2,3γ2 subunit variants mediate most of the GABA induced phasic currents in GluR cells. These subunits form receptors in neurons as well. Hence the lower affinity for GABA of receptors in GluR cells is due to posttranslational modifications. GluR cells display both phasic and tonic currents. The latter ones were mediated through perisynaptic receptors in Neurons. Transcript analysis revealed that composition of these receptors is different in GluR cells and neurons. Hippocampal tissue of mouse, rat and human was tested for P2X receptors. There was no evidence for functional P2X receptors in hippocampal GluR and GluT cells. Neither rapid application of ATP via photolysis nor specific receptor agonists could induce currents in these cells. Further experiments with P2X₇ knockout mice showed, that slow ATP mediated currents are attributed to indirect effects. The hypothesis proclaimed by other publications that activation of P2X receptors leads to glutamate release in GluR and GluT cells could therefore not be confirmed.