Untersuchungen zu Funktionen definierter cytosolischer Epitope des neuralen Zelladhäsionsmoleküls NCAM

Abstract

In dieser Arbeit wurden Funktionen von definierten Epitopen der cytosolischen Domänen von NCAM140 und NCAM180, der beiden Transmembran-Isoformen des neuralen Zelladhäsionsmoleküls, untersucht.<br /> Durch den Austausch des innerhalb einer PEST-Sequenz gelegenen Threonins 803 von NCAM140 gegen Aspartat (T803D) oder Alanin (T803A) konnte gezeigt werden, dass eine Phosphorylierung dieser Aminosäure für die Endocytose von NCAM sowie das Neuritenwachstum von NCAM140-transfizierten B35-Zellen von Bedeutung ist. Darüber hinaus weisen die Ergebnisse stark darauf hin, dass die MAP-Kinase direkt oder indirekt an dieser Phosphorylierung beteiligt ist.<br /> Des weiteren wurden in dieser Arbeit die letzten sechs C-terminalen Aminosäuren (ENESKA) von NCAM140 und NCAM180 deletiert, welche ein PDZ-Bindemotiv enthalten. Die NCAM140-ΔENESKA-exprimierenden B35-Zellen zeigten allerdings weder bzgl. des Neuritenwachstums noch der Endocytose signifikante Unterschiede im Vergleich zu NCAM140-WT-exprimierenden Zellen, so dass davon ausgegangen werden kann, dass das PDZ-Bindemotiv keinen Einfluss auf diese Prozesse hat.<br /> Weiterhin wurde das durch eine Metalloprotease katalysierte und durch den Tyrosinphosphatase-Inhibitor Pervanadat induzierte „Shedding“ der extrazellulären Domäne von NCAM untersucht. Es konnten keine Unterschiede zwischen NCAM140/180-WT- und NCAM140/180-ΔENESKA-exprimierenden B35-Zellen festgestellt werden. Jedoch konnte mit Hilfe von NCAM140/180-eGFP-Fusionsproteinen gezeigt werden, dass sich nach Pervanadat-Behandlung die NCAM-Internalisierung ins Cytosol signifikant erhöht. Aus den Experimenten lässt sich schließen, dass Endocytose von NCAM während des Pervanadatinduzierten, Metalloprotease-abhängigen „Sheddings“ durch einen MAP-Kinase-abhängigen Mechanismus verstärkt wird. Allerdings konnte nicht festgestellt werden, ob sich in den Vesikeln nur vollständiges NCAM oder auch „gesheddete“ intrazelluläre oder extrazelluläre NCAM-Fragmente befinden.<br /> Außerdem wurde auch die Migration der mit den genannten mutierten cDNAs stabil transfizierten B35-Zellen untersucht. Dabei konnten allerdings mittels Timelapse-Messungen lediglich geringfügig hemmende (NCAM140-T803A) bzw. fördernde (NCAM140-T803D) Einflüsse dieser Mutationen ± homophiler NCAM-NCAM-Interaktion festgestellt werden. Migrationsstudien der NCAM140/180-ΔENESKA-exprimierenden Zellen führten zu der Erkenntnis, dass ein Fehlen der ENESKA-Domäne für die Zellmotilität auf dem ECM-Protein Laminin von Bedeutung ist. Während diese Mutation ähnlich wie die T803A- und T803DMutationen nur geringe Effekte bzgl. der Zellwanderung auf PLL und COS-7- sowie NCAM140-exprimierenden COS140-Zellen zeigten, migrierten die ΔENESKA-Mutanten, vor allem NCAM180-ΔENESKA, auf Laminin hochsignifikant schneller als die entsprechenden NCAM-WT-exprimierenden Zellen. Es ist anzunehmen, dass durch das Fehlen der ENESKADomäne die Interaktion mit einem möglichen cytoskelettalen Bindungspartner verhindert wird, wodurch die korrekte Zellmigration auf Laminin gestört wird.<br /> Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass bestimmte cytosolische Epitope von NCAM bei Neuritenwachstum, Endocytose und Zellmigration von Bedeutung sind.