Chemical Investigation of <em>Streptomyces Albus</em> Heterologous Expression Strains and The Biosynthesis of the Aromatic Polyketide Griseorhodin A

Abstract

Griseorhodin A is a member of the rubromycins, a group of aromatic polyketides with unique structures. Members of this group such as γ-rubromycin and heliquinomycin inhibit HIV reverse transcriptase and human telomerase. Both pharmacological activities depend on the presence of a highly unusual spiroketal moiety, but how the bacteria achieve the biosynthesis of this pharmacophore has not been understood completely.<br /> In previous work, the griseorhodin A biosynthetic gene cluster was isolated and sequenced and a heterologous expression system was created to study griseorhodin A biosynthesis 17 mutant strains lacking biosynthetic genes were prepared by Kathrin Reinhardt for her PhD work. The aim of this PhD study was the development of cultivation procedures, the chemical investigation, and the characterization of the metabolites and shunt products from the griseorhodin A pathway, focusing on the function of the 11 griseorhodin A tailoring enzymes performing the post-PKS steps and the function as-yet undetermined genes. <br /> Heterologous expression and metabolic analysis of the strains enabled the assignment of most genes to various stages of griseorhodin A biosynthesis, the identification of tailoring enzymes and the study of the pharmacophore generation process. In addition to griseorhodin A, seven metabolites, didesoxygriseorhodin C, collinone, ZY1, lenticulone, precollinone, KS-619-3 and secocollinone-1, were isolated, which are present in the extracts of fourteen producing mutant strains. With the data obtained from the HR-LCMS experiments and structure elucidation, a new biosynthetic pathway for griseorhodin A was postulated. Among the substances isolated for the biosynthesis studies, the structures of the compounds ZY1, lenticulone, precollinone, KS-619-3 and secocollinone-1 were identified as new. In addition to biosynthesis studies, an in vito enzyme activity assay for the oxygenase GrhO6 with the isolated metabolite lenticulone was conducted to stud biosynthesis.<br /> It was also tested, how the degree of oxidative modification during griseorhodin A biosynthesis affects bioactivity. The compounds griseorhodin A, didesoxygriseorhodin C, collinone, precollinone and lenticulone showed antibacterial activity to Gram-positive bacteria Staphylococcus carnosus, Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus subtilis. The MIC values for the inhibitory activity were determined. collinone and griseorhodin A showed the highest antibacterial activity.<br /> Serine protease-inhibiting activity for the compounds and extracts were tested in the group of Prof. Michael Gütschow, at the University of Bonn. For griseorhodin A, didesoxygriseorhodin C, collinone, and lenticulone a considerable inhibiting activity to human leukocyte elastase (HLE) was determined. The highest HLE-inhibiting activity is displayed by didesoxygriseorhodin C. (IC50=3.10±0.83 µg mL-1) The results impliy that the griseorhodin-type compounds could represent a new class of candidates for HLE inhibitors. <br /> Cytotoxic and antiproliferative activities of griseorhodin A, didesoxygriseorhodin C, collinone, and lenticulone were determined in the group of Hans-Martin Dahse in HKI, Jena. In general, the activities of all of these compounds were moderate and in the same range.<br /> In addition, the absolute configuration of griseorhodin A, collinone and precollinone was determined by quantum chemical circular dichroism (CD) calculations in combination with experimental CD measurements in the group of Prof. Gerhard Bringmann, at the University of Würzburg.

<strong>Chemische Untersuchung der Streptomyces Albus Heterologes Expression Stämme and die Biosynthesestudie zum aromatischen Polyketid Griseorhodin A</strong><br /> Griseorhodin A ist ein Vertreter der Rubromycin-Familie der aromatischen Polyketide. Die Vertreter wie das γ-Rubromycin und das Heliquinomycin inhibieren HIV reverse Transkriptase und die menschliche Telomerase. Beide pharmakologischen Aktivitäten sind abhängig von der Spiroketal-Einheit der Substanzen. Bislang konnte nicht vollständig aufgeklärt werden, wie die Bakterien dieses Pharmacophore erzeugen. <br /> In früheren Arbeiten wurde der Griseorhodin-Gencluster aus Streptomyces sp. JP95 isoliert und ein heterologes Expressionssystem erzeugt. Um die Griseorhodin A Biosynthese zu studieren, wurde von Kathrin Reinhardt in ihrer Dissertation 17 Mutantenstämme generiert, denen Biosynthesegene fehlen. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist die Entwicklung effizienter Kultivierung-Protokolle, die chemisch-analytische Untersuchung und Strukturaufklärung der Metaboliten der Mutantenstämme mit Fokus auf der Funktion der 11 Post-PKS Oxygenasen sowie der Enzyme, deren Rollen in der Biosynthese bislang nicht aufgeklärt werden konnte. <br /> Anhand der Ergebnisse war die Zuordnung der meisten Polyketid modifizierenden Enzyme und die Aufklärung der wesentlichen Schritte in der Pharmakophorebiosynthese möglich. Zusätzlich zum Metabolit Griseorhodin A wurden Didesoxygriseorhodin C, Collinon, ZY1, Lenticulon, Precollinon, KS-619-3 und Secocollinon-1 isoliert und strukturell characterisiert. Anhand der Ergebnisse der HR-LCMS-Analysen und der aufgeklärten Strukturen konnte ein Verlauf der Biosynthese von Griseorhodin A postuliert werden. Unter den Metaboliten, konnten als neue Naturstoffe die Strukturen von ZY1, Lenticulon, Precollinon, KS-619-3 und Secocollinon-1 identifiziert werden. Zusätzlich zu den Biosynthesestudien wurde eine Untersuchung der in vitro Enzymaktivität für die Oxygenase GrhO6 durchgeführt. <br /> In Bioaktivitätsstudien haben Griseorhodin A, Didesoxygriseorhodin C, Collinon, Precollinon und Lenticulon antibakterielle Aktivitäten gegen die Gram-positiven Stämme Staphylococcus carnosus, Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus subtilis gezeigt. Die MIC-Werte wurden bestimmt. Collinone und Griseorhodin A haben die höchsten antibakteriellen Aktivitäten gezeigt. <br /> Die Serine-Protease-inhibierende Wirkung der Substanzen und Mutant-extrakte wurde in der Gruppe von Prof. Michael Gütschow am Pharmazeutischen Institut der Universität Bonn untersucht. Griseorhodin A, Didesoxygriseorhodin C, Collinon, und Lenticulon besitzen eine hohe hemmende Wirkung gegen die menschliche Leucocyten Elastase (HLE). Die stärkste HLE-Hemmung wurde für Didesoxygriseorhodin C nachgewiesen (IC50=3.10±0.83 µg mL-1). Aufgrund dieser Ergebnisse Substanzen der Griseorhodintyps gute Kandidaten für eine neue Klasse von HLE-Inhibitoren sein. <br /> Zytotoxizitäten und antiproliferative Wirkungen der isolierten Substanzen wurden von Hans-Martin Dahse am HKI, Jena, bestimmt. Bei den Substanzen Griseorhodin A, Didesoxygriseorhodin C, Collinon, und Lenticulon wurden moderate Zytotoxizitäten und antiproliferative Wirkungen ermittelt. <br /> Auβerdem wurde in einer weiteren kooperation die vollständige Strukturaufklärung die absoluten Konfigurationen von Griseorhodin A, Collinon und Precollinon durch quantenchemische Circulardichroismus-Kalkulationen in Kombination mit experimentellen Circulardichroismus-Werten in der Gruppe von Prof. Gerhardt Bringmann an der Universität Würzburg bestimmt.