Untersuchung mikrobieller Glasbildner für die Biostabilisierung und biomimetische Applikation in einem Biosensor

Abstract

Im Sinne der Bionik (biologisch inspirierte Lösungen für technische Fragestellungen) setzt sich diese Arbeit mit dem Prinzip der Vitrifikation während der Anhydrobiose auseinander. Sie ist durch die temporäre Ausbildung organischer Gläser in biologischen Systemen bei extremer Austrocknung definiert. Das Resultat ist eine Art Dormanzzustand (motorische und metabolische Inaktivität). Diese Glasbildung zeichnet sich ferner durch Reversibilität bei Rehydrierung und den Erhalt der Bioaktivität der verglasten Komponenten aus. Die Applikation der Vitrifikation wurde hinsichtlich der biotechnologischen Trockenstabilisierung (<em>anhydrobiotic engineering</em>) als auch im Rahmen der Nanobiotechnologie (Biosensorik) realisiert. Dadurch liefert diese Arbeit vielversprechende Ansätze für die kosteneffiziente Lagerung von trocknungsempfindlichen Biosystemen (Zellen), einzelnen Biomolekülen (Proteinen) sowie Hybridsystemen (Biosensoren) in der Pharmazie, Landwirtschaft und Lebensmittelindustrie.<br /> Die Basis bilden biologische Studien zum moderat halophilen Modellorganismus <i>Halomonas elongata</i>, welcher fähig ist die harschen Bedingungen bei Austrocknung (erhöhte Temperaturen und geringe Wasseraktivitäten) zu überleben. Entscheidend für die Überlebensfähigkeit des extremophilen Bakteriums ist offenbar der intrazellulär akkumulierte Glasbildner Hydroxyectoin (vermutlich in Kombination mit Glutamat). Zusätzliche Komponenten (Hydrophiline, Polyphosphate oder anorganische Ionen), die wesentlich zur Glasbildung im halophilen Modellorganismus beitragen könnten, waren experimentell nicht nachweisbar, können jedoch nicht ausgeschlossen werden. <br /> Stabilitätstests belegten, dass Hydroxyectoin-beladene Zellen durch<i>In-vivo</i>-Vitrifikation bis zu sechsfach trockentoleranter sind als Ectoin-beladene Zellen. <i>In-vitro</i>-Studien demonstrierten ferner die Fertigung artifizieller Gläser basierend auf Hydroxyectoin (ähnlich Trehalose und Saccharose), wohingegen Ectoin verstärkt zur Kristallisation tendierte. Das Modellenzym Lactatdehydrogenase konnte so insbesondere durch mikrobiologische Glasbildner (Trehalose, Saccharose, Hydroxyectoin, Glutamat) effektiv bei simultanem Hitze- und Trockenstress geschützt werden. Dies traf nicht für das ungeschützte bzw. Ectoin-modifizierte Enzym zu. Die Approximation natürlicher Gläser durch die zusätzliche Verwendung der Hydrophilin-analogen Peptidstruktur Gelatine resultierte in einer weiteren Steigerung des Stabilisierungseffekts. Durch das Zwei-Komponenten-System aus Hydroxyectoin und Glutamat in Kombination mit Gelatine wurde ein fast vollständiger Erhalt der enzymatischen Aktivität nach mehrstündiger Trocknung erreicht. <br /> Im weiteren Verlauf des bionischen Ansatzes wurde sich auf das technische Problem der Instabilität von Biosensoren bei Trockenlagerung fokussiert. Dazu wurde ein elektrochemischer Glucose-Biosensor auf Basis von mehrwandigen Kohlenstoffnanoröhren (MWCNT) <i>ad hoc</i> konstruiert. In Trocknungsversuchen zeigte sich, dass Biosensoren, welche mit Hydroxyectoin bzw. mit Hydroxyectoin und Glutamat modifiziert waren, die höchste Aktivität und Stabilität aufwiesen. Es bleibt die Frage offen, ob dies durch einen Stabilisierungseffekt oder durch einen Elektronenfluss begünstigenden Einfluss der Glasbildner auf die MWCNTs bedingt ist. Beides ist für die Konstruktion wirkungsvoller Biosensoren vorteilhaft.

<strong>Investigation of microbial glass-formers for biostabilisation and biomimetic application in a biosensor</strong><br /> In terms of bionics (biologically inspired solution for technical problems) this work investigates the principle of vitrification during anhydrobiosis. This natural phenomenon is defined as temporal formation of an organic glass in biological systems in response to extreme desiccation. It results in a kind of dormant state (motor and metabolic inactivity). The glassy state is further characterized by reversibility through rehydration and the simultaneous maintenance of bioactivity of vitrified components. Vitrification was applied with regard to biotechnological dry stabilisation (<i>anhydrobiotic engineering</i>) and in the context of nanobiotechnology (biosensorics). As a result this works provides promising approaches for cost-effective storage of dry sensitive biosystems (cells), single biomolecules (proteins) and hybrid systems (biosensors) in pharmaceutical, agricultural and food industry. <br /> This work is based on biological studies about the moderate halophilic model organism <i>ad hoc</i> which is able to survive the extreme conditions during desiccation (elevated temperatures and low water activities). Obviously the intracellular accumulation of the glass former hydroxyectoine is crucial for the survivability of this extremophilic bacterium (presumably in combination with glutamate). Although additional components (hydrophilins, polyphosphates or inorganic ions), which could also contribute to formation of a bioprotective glass in the halophilic model organism, were experimentally not detectable, they cannot exclusively be neglected. <br /> Stability assays pointed out that hydroxyectoine loaded cells show six times higher dry resistance through <i>ad hoc</i> vitrification in comparison to primary ectoine loaded cells. <i>ad hoc</i>studies further demonstrated the artificial glass-formation of hydroxyectoine (similar to glasses of trehalose and sucrose). In contrast ectoine strongly tends to crystallisation. The model enzyme lactate dehydrogenase was efficiently stabilised against simultaneous heat and dehydration stress by application of microbial glass-formers (trehalose, sucrose, hydroxyectoine, glutamate). In contrast the unstabilised and ectoine-modified enzyme was fast inactivated. The approximation of natural glasses by additional application of a hydrophilin-like peptide structure (gelatine) further increases the stabilisation effect. Best results were obtained using the two-component system hydroxyectoine and glutamate combined with gelatine. Such glasses resulted in almost complete maintenance of enzymatic bioactivity after several hours of drying. <br /> Finally the bionic research was focused on the technical problem of instability of biosensor during dry storage. For this purpose an electrochemical biosensor based on multi-walled carbon nanotubes (MWCNT) was <i>ad hoc</i> constructed. Drying experiments indicated that hydroxyectoine and hydroxyectoine-glutamate modified biosensors show the highest activity and stability. It remains questionable whether this was caused by a stabilising effect or by an improvement of electron transfer. Both are advantageous for the construction of effective biosensors.