Gläsker, Sabine: Untersuchungen zur antiviralen Aktivität des humanen Zinkfinger antiviralen Proteins gegen Alphaviren. - Bonn, 2014. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-37424
@phdthesis{handle:20.500.11811/6172,
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year = 2014,
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note = {Das Zinkfinger antivirale Protein (ZAP) wurde als antiviraler Wirtsfaktor identifiziert, der die Replikation und Verbreitung verschiedener Viren inhibiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die antivirale Aktivität der beiden Isoformen des humanen ZAP-Orthologs, hZAP-L und hZAP S, gegen Alphaviren untersucht. Beide Isoformen unterscheiden sich lediglich anhand der zusätzlichen C-terminalen Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP)-ähnlichen Domäne des hZAP-L, die aber offenbar katalytisch inaktiv ist.
Für beide Isoformen wurden induzierbare Expressionszelllinien generiert und die Hemmung verschiedener humanpathogener Alphaviren durch hZAP-L und hZAP-S in Infektionskinetiken analysiert. Während das Ausmaß der Inhibition generell zwischen den einzelnen Viren variierte, war die Hemmung durch hZAP-L dabei jeweils stärker als durch hZAP-S. Mithilfe eines spezifischen, siRNA-vermittelten hZAP-L-knockdown konnte auch die effektive antivirale Aktivität des endogenen hZAP-L nachgewiesen werden.
Die Relevanz des charakteristischen Triadenmotivs der PARP-ähnlichen Domäne für die antivirale Aktivität des hZAP-L konnte anhand von Mutationsstudien eindeutig demonstriert werden. Interessanterweise wurde die antivirale Aktivität des hZAP-L nach Einbringen des Triadenmotivs katalytisch aktiver PARPs nicht verstärkt, sondern nahezu aufgehoben und dadurch sogar weniger wirksam als die des hZAP-S. Trotz der katalytischen Inaktivität ist die PARP-ähnliche Domäne demnach essenziell für die effektive antivirale Aktivität des hZAP-L. Eine zelluläre Umverteilung der inaktiven hZAP-L-Mutante konnte dabei nicht als Ursache für den Aktivitätsverlust identifiziert werden.
ZAP inhibiert das Viruswachstum, indem es die virale Translation hemmt, vor allem aber die Degradation der viralen RNA veranlasst, nachdem es an spezifische ZAP responsive elements (ZRE) der viralen RNA gebunden hat. Hier konnte gezeigt werden, dass die Insertion eines bekannten ZAP-sensitiven ZRE die Empfindlichkeit eines Virus gegen hZAP-L zwar geringfügig erhöht, die virale Sensitivität aber offenbar stärker durch andere Faktoren bestimmt wird. In der Literatur wird die Makrodomäne des alphaviralen nsP3 als möglicher ZAP-Antagonist diskutiert. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit anhand verschiedener Makrodomänen-Chimären und -Mutanten auf Basis der verfügbaren reversen Genetiksysteme des Chikungunya-Virus (CHIKV) und Sindbis-Virus (SINV) analysiert. Dabei fiel vor allem der Aminosäure eine besondere Bedeutung zu, die für die ADP-Ribose-Bindung der Makrodomäne verantwortlich ist (SINV N10, CHIKV D10). Zudem konnte eine direkte Interaktion zwischen hZAP-L und dem nsP3 des CHIKV nachgewiesen werden, die von der Anwesenheit der Makrodomäne abhängt und von der Integrität der Aminosäure D10 beeinflusst wird.
Um zu untersuchen, ob ein direkter Zusammenhang zwischen der Hemmbarkeit eines Alphavirus mit dessen Vermögen ADP-Ribose zu binden besteht, wurde die ADP-Ribose-Affinität der Makrodomänen des CHIKV, SINV und O’nyong-nyong-Virus durch isothermale Titrationskalorimetrie definiert. Tatsächlich stieg mit der gemessenen ADP-Ribose-Affinität die Unempfindlichkeit der Viren gegenüber der hZAP-L-vermittelten Inhibition. Für die PARP-ähnliche Domäne des hZAP-L konnte dabei keine ADP-Ribose-Affinität detektiert werden. Die Theorie, dass hZAP-L von anderen Mitgliedern der PARP-Familie transribosyliert wird, wurde hier mit PARP12 und PARP15 untersucht, konnte jedoch nicht bestätigt werden.
Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit die Interaktion zwischen hZAP, der PARP-ähnlichen Domäne des hZAP-L und der alphaviralen Makrodomäne bei der hZAP-vermittelten Alphavirus-Hemmung tiefergehend analysiert werden. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse über die Spezifität des hZAP und die alphavirale Sensitivität gegenüber hZAP liefern eine wertvolle Grundlage für zukünftige Studien zur weiterführenden Untersuchung der antiviralen Aktivität des hZAP.},

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