Untersuchungen zur antiviralen Aktivität des humanen Zinkfinger antiviralen Proteins gegen Alphaviren

Abstract

Das Zinkfinger antivirale Protein (ZAP) wurde als antiviraler Wirtsfaktor identifiziert, der die Replikation und Verbreitung verschiedener Viren inhibiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die antivirale Aktivität der beiden Isoformen des humanen ZAP-Orthologs, hZAP-L und hZAP S, gegen Alphaviren untersucht. Beide Isoformen unterscheiden sich lediglich anhand der zusätzlichen C-terminalen Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP)-ähnlichen Domäne des hZAP-L, die aber offenbar katalytisch inaktiv ist.<br /> Für beide Isoformen wurden induzierbare Expressionszelllinien generiert und die Hemmung verschiedener humanpathogener Alphaviren durch hZAP-L und hZAP-S in Infektionskinetiken analysiert. Während das Ausmaß der Inhibition generell zwischen den einzelnen Viren variierte, war die Hemmung durch hZAP-L dabei jeweils stärker als durch hZAP-S. Mithilfe eines spezifischen, siRNA-vermittelten hZAP-L-<i>knockdown</i> konnte auch die effektive antivirale Aktivität des endogenen hZAP-L nachgewiesen werden.<br /> Die Relevanz des charakteristischen Triadenmotivs der PARP-ähnlichen Domäne für die antivirale Aktivität des hZAP-L konnte anhand von Mutationsstudien eindeutig demonstriert werden. Interessanterweise wurde die antivirale Aktivität des hZAP-L nach Einbringen des Triadenmotivs katalytisch aktiver PARPs nicht verstärkt, sondern nahezu aufgehoben und dadurch sogar weniger wirksam als die des hZAP-S. Trotz der katalytischen Inaktivität ist die PARP-ähnliche Domäne demnach essenziell für die effektive antivirale Aktivität des hZAP-L. Eine zelluläre Umverteilung der inaktiven hZAP-L-Mutante konnte dabei nicht als Ursache für den Aktivitätsverlust identifiziert werden.<br /> ZAP inhibiert das Viruswachstum, indem es die virale Translation hemmt, vor allem aber die Degradation der viralen RNA veranlasst, nachdem es an spezifische <i>ZAP responsive elements</i> (ZRE) der viralen RNA gebunden hat. Hier konnte gezeigt werden, dass die Insertion eines bekannten ZAP-sensitiven ZRE die Empfindlichkeit eines Virus gegen hZAP-L zwar geringfügig erhöht, die virale Sensitivität aber offenbar stärker durch andere Faktoren bestimmt wird. In der Literatur wird die Makrodomäne des alphaviralen nsP3 als möglicher ZAP-Antagonist diskutiert. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit anhand verschiedener Makrodomänen-Chimären und -Mutanten auf Basis der verfügbaren reversen Genetiksysteme des Chikungunya-Virus (CHIKV) und Sindbis-Virus (SINV) analysiert. Dabei fiel vor allem der Aminosäure eine besondere Bedeutung zu, die für die ADP-Ribose-Bindung der Makrodomäne verantwortlich ist (SINV N10, CHIKV D10). Zudem konnte eine direkte Interaktion zwischen hZAP-L und dem nsP3 des CHIKV nachgewiesen werden, die von der Anwesenheit der Makrodomäne abhängt und von der Integrität der Aminosäure D10 beeinflusst wird.<br /> Um zu untersuchen, ob ein direkter Zusammenhang zwischen der Hemmbarkeit eines Alphavirus mit dessen Vermögen ADP-Ribose zu binden besteht, wurde die ADP-Ribose-Affinität der Makrodomänen des CHIKV, SINV und O’nyong-nyong-Virus durch isothermale Titrationskalorimetrie definiert. Tatsächlich stieg mit der gemessenen ADP-Ribose-Affinität die Unempfindlichkeit der Viren gegenüber der hZAP-L-vermittelten Inhibition. Für die PARP-ähnliche Domäne des hZAP-L konnte dabei keine ADP-Ribose-Affinität detektiert werden. Die Theorie, dass hZAP-L von anderen Mitgliedern der PARP-Familie transribosyliert wird, wurde hier mit PARP12 und PARP15 untersucht, konnte jedoch nicht bestätigt werden.<br /> Insgesamt konnte in der vorliegenden Arbeit die Interaktion zwischen hZAP, der PARP-ähnlichen Domäne des hZAP-L und der alphaviralen Makrodomäne bei der hZAP-vermittelten Alphavirus-Hemmung tiefergehend analysiert werden. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse über die Spezifität des hZAP und die alphavirale Sensitivität gegenüber hZAP liefern eine wertvolle Grundlage für zukünftige Studien zur weiterführenden Untersuchung der antiviralen Aktivität des hZAP.

<strong>Studies on the antiviral activity of the human zinc finger antiviral protein against alphaviruses</strong><br /> The zinc finger antiviral protein (ZAP) was identified as an antiviral host factor which inhibits the replication and dissemination of various viruses. In the present study the antiviral activity against alphaviruses was explored for the two isoforms of the human ZAP ortholog, hZAP-L and hZAP-S. The only difference between both isoforms is the accessory poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)-like domain in the C-terminus of hZAP-L which, however, has shown to be catalytically inactive.<br /> For both, hZAP-L and hZAP-S, inducible expression cell lines were generated and the inhibitory action against different human-pathogenic alphaviruses was analyzed by growth kinetics. Despite the fact that the level of inhibition varied among different alphaviruses, hZAP-L-mediated inhibition was in general more potent compared to hZAP-S. Using siRNA-mediated knockdown specifically targeting hZAP-L, the antiviral activity of endogenous hZAP L was also proven.<br /> Mutational studies clearly demonstrated the importance of the characteristic triad motif within the PARP-like domain for the antiviral activity of hZAP-L. Intriguingly, the introduction of the triad motif of catalytically active PARPs did not enhance, but virtually abolish the antiviral activity of hZAP-L thus rendering hZAP-L even less effective than hZAP-S. Hence, the PARP-like domain is essential for an effective antiviral activity of hZAP-L albeit its catalytic inactivity. A subcellular redistribution of the inactive hZAP-L mutant could not be found to account for the observed loss of activity.<br /> ZAP inhibits virus growth by repressing viral translation and especially by inducing the degradation of viral RNA after binding to specific ZAP responsive elements (ZRE). In the present study it could be shown that introduction of a known ZAP-sensitive ZRE only slightly enhanced viral susceptibility to ZAP-mediated inhibition suggesting that another factor might determine alphaviral sensitivity more strongly. Different studies consider the macro domain of the alphaviral nsP3 to be a possible ZAP antagonist. This hypothesis was tested employing various chimeras and macro domain mutants generated based on the reverse genetics systems available for Chikungunya virus (CHIKV) and Sindbis virus (SINV). Particularly, the amino acid mediating ADP-ribose binding of the macro domain was found to be important (SINV N10, CHIKV D10). Furthermore, a direct interaction between hZAP-L and the CHIKV nsP3 was detected which depended on the presence of the macro domain and was influenced by the integrity of its amino acid D10.<br /> In order to analyze a possible correlation for alphaviruses between their level of inhibition by hZAP-L and their capability to bind ADP-ribose, the ADP-ribose affinity of the macro domains of CHIKV, SINV and O’nyong-nyong virus was measured by isothermal titration calorimetry. Indeed, an increasing potency to bind ADP-ribose correlated with a decreasing susceptibility to hZAP-L-mediated inhibition. In contrast, no ADP-ribose affinity was measured for the PARP-like domain of hZAP-L. The possibility for hZAP-L to become ADP-ribosylated by other members of the PARP family was assessed using PARP12 and PARP15 in enzymatic assays, but could not be confirmed.<br /> Altogether, the present study could enlighten the interplay between hZAP, the PARP-like domain of hZAP-L and the alphaviral macro domain in hZAP-mediated alphavirus inhibition in more detail. These new insights about the specificity of hZAP as well as the alphaviral sensitivity towards it provide a valuable basis for future studies investigating the antiviral activity of hZAP.