Immune regulation in <em>Plasmodium berghei</em> ANKA infected mice either lacking type I interferon signalling or mimicking malaria tolerance

Abstract

Malaria is a disease caused by <em>Plasmodium</em> parasites and transmitted by female <em>Anopheles</em> mosquitoes. Children under the age of five, pregnant women and none-immune individuals are at risk of developing severe malaria such as cerebral malaria (CM), caused only by <em>P. falciparum.</em> During <em>Plasmodium</em> infection, the parasite and its products are recognised by pattern recognition receptors on myeloid cells and dendritic cells (DCs) in the spleen resulting in the secretion of pro and anti- inflammatory cytokines, which can drive the disease to either a severe outcome or induce tolerance.<br /> Among the secreted cytokines are the type I interferons (IFNs), which signal via the heterodimeric interferon alpha receptor (Ifnar). In the first part of this thesis we show that type I IFN signalling via the receptor on myeloid cells plays a crucial role in the mediation of pathology during infection with <em>P. berghei</em> ANKA. Mice that lack the receptor on myeloid cells (LysM^Cre<em>Ifnar1^f</em>^l/fl) had a phenotype comparable to the full (knockout) ko mice (<em>Ifnar1</em>^-/-). Upon PbA-infection, these mice showed a stable blood brain barrier, had very few cells (such as CD8⁺ T cells, CD4⁺ T cells NK cells and Ly6C^hi inflammatory monocytes) present in their brains and low inflammatory mediators in comparison to the wild type (WT) mice and the mice that lack the receptor on DCs (CD11c^Cre<em>Ifnar1</em>^fl/fl). Although these mice were protected from ECM, they were able to recognise endogenous parasite-specific antigen and transgenic antigen and to mount a specific cytolytic response in the spleen. Importantly, these effector cytotoxic CD8⁺ T cells were retained/arrested in the spleen. In the absence of Ifnar on myeloid cells or on all cells, the mice had less Ly6C^hi inflammatory monocytes in their spleens. <br /> Importantly, the protected mice contained a special subset of macrophages showing an immune-regulatory phenotype. We found in spleens of PbA-infected Ifnar ko alternatively activated macrophages (M2), which expressed <em>YM-1</em>, <em>Relm α</em> / <em>Fizz </em>and <em>Arg-1</em> and produced IL-10 and arginase. However, mice that lacked the receptor specifically on myeloid cells contained very low amount of these cells in their spleens but they had high levels of IL-10 and IL-6, which could have been produced by another form of suppressive/regulatory macrophages. We conclude that these cells contributed to creating a suppressive milieu in the spleens of the protected mice, resulting in retention of immune cells in the spleen. The change in the macrophage phenotype to a suppressive/immunoregulatory phenotype occurred without altering the Th-1 response. <br /> In the second part of this thesis we analysed the changes in the immune response after infection with elevated parasite dose, which resulted in protection from ECM, thereby mimicking malaria tolerance experimentally. This was mediated by complete blockage of IFNγ production and partial suppression of the Th1 response. Also the high parasite dose resulted in suppression of the expression of MHC class II on Ly6C^hi inflammatory monocytes. Using mice that are genetically deficient of IL-10 on myeloid cells, we showed that the IL-10 production by myeloid cells had a crucial role in the protection of mice from ECM in this malaria tolerance model. In conclusion; our results showed that during infection with <em>Plasmodium berghei</em> ANKA, type I IFN inflammatory signalling and production of IL-10 by myeloid cells, mostly macrophages and monocytes, are crucial in driving the disease to either the severe outcome that is observed in C57BL/6 or tolerance that is observed in the high dose infected mice.

Malaria ist eine Krankheit, die durch eine Infektion mit Parasiten der Gattung <em>Plasmodium</em> entsteht und durch weibliche <em>Anopheles</em> Mücken übertragen wird. Besonders Kinder unter 5 Jahren, schwangere Frauen und nicht-immune Reisende haben ein hohes Risiko, eine schwere Malaria zu entwickeln, wie zum Beispiel zerebrale Malaria (ZM), die nur durch <em>P. falciparum</em> verursacht wird. Während einer <em>Plasmodium</em>-Infektion wird der Parasit selbst und von ihm ausgeschiedene Produkte in der Milz durch sogenannte Mustererkennungsrezeptoren auf myeloiden und dendritischen Zellen (DZs) erkannt und lösen in diesen Zellen die Ausscheidung von verschiedenen pro- und anti-entzündlichen Mediatoren aus, die entweder eine schwere Verlaufsform der Krankheit begünstigen oder Immuntoleranz induzieren können. Unter den freigesetzten Zytokinen befinden sich Typ I Interferone (IFNs), die an den heterodimeren Interferon alpha Rezeptor (Ifnar) binden und weitere Schritte der Immunantwort induzieren. Im ersten Teil dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass die Typ I IFN Signalkaskade über den Rezeptor auf myeloiden Zellen eine wichtige Rolle in der Pathologie einer <em>P. berghei</em> ANKA-Infektion (PbA) spielt, die ein akzeptiertes Mausmodell für die Entstehung von ZM im Menschen darstellt (experimentelle ZM (EZM)). Mäuse, denen der IFN alpha Rezeptor auf myeloiden Zellen fehlt (LysM^Cre<em>Ifnar1</em>^fl/fl), zeigen einen ähnlichen Krankheitsverlauf wie Tiere, denen der Rezeptor auf allen Zellen fehlt (<em>Ifnar1</em>^-/-). Nach einer PbA-Infektion zeigten diese Tiere im Vergleich zu Wildtyp (WT) Mäusen und Mäusen, denen der Rezeptor auf Dendritischen Zellen fehlt (CD11c^Cre<em>Ifnar1</em>^fl/fl), eine intakte Blut-Hirn-Schranke und geringe Mengen an periphere Immunzellen (wie etwa CD8⁺ T Zellen, CD4⁺ T Zellen, NK Zellen und Ly6C^hi inflammatorische Monozyten) und Entzündungsmarkern im Gehirn. Trotz ihres Schutzes vor EZM konnte in LysMCreIfnar1fl/fl Mäusen endogenes parasiten-spezifisches und transgenes Antigen erkannt werden und eine spezifische zytolytische Immunantwort in der Milz gebildet werden. Interessanterweise verblieben die zytotoxischen CD8⁺ T Zellen aber in der Milz und migrierten nicht ins Gehirn der Tiere. Milzen aus Mäusen, denen Ifnar auf myeloiden oder auf allen Zellen fehlte, hatten allerdings eine geringere Anzahl an Ly6C^hi inflammatorischen Monozyten. Von besonderer Bedeutung war, dass in geschützten genetisch defizienten (ko) Mäusen ein besonderer Untertyp von Makrophagen gefunden wurde, der für seine regulatorischen Eigenschaften bekannt ist. Wir konnten in Milzen der PbA-infizierten <em>Ifnar1</em>^-/- Mäuse sogenannte alternativ aktivierte Makrophagen (M2) nachweisen, die <em>YM-1, Relm α / Fizz </em>und<em> Arg-1</em> exprimierten und außerdem IL-10 und Arginase produzierten. Allerdings konnten wir diese Zellen in LysM^Cre<em>Ifnar1</em>^fl/fl Mäusen nur in geringer Anzahl finden, konnten dafür aber dort erhöhte Mengen an IL-10 und IL-6 nachweisen, die auch von anderen supprimierenden / regulierenden Makrophagen sekretiert werden können. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass diese Zellen ein regulatorisches Milieu begünstigen, welches zum Verbleib der Immunzellen in der Milz führt. Die Th-1 Antwort nach PbA-Infektion wurde allerdings durch die Änderungen des Phänotyps der Makrophagen in eine supprimierende / regulierende Art nicht beeinflusst. <br /> Im zweiten Teil dieser Arbeit untersuchten wir die Änderungen in der Immunantwort nach einer Infektion mit einer höheren Dosis an Parasiten, die zum Schutz vor EZM in WT Mäusen führte, was einer experimentell induzierten Malariatoleranz entspricht. Diese Toleranz konnte auf die vollständige Verhinderung der IFNγ-Produktion und eine Reduzierung der Th-1 Antwort zurückgeführt werden. Die höhere Parasiten-Dosis resultierte außerdem in einer reduzierten Expression von MHC Klasse II Molekülen auf inflammatorischen Monozyten. Mithilfen von Mäusen, deren myeloide Zellen kein IL-10 produzieren, konnten wir zeigen, dass IL-10 aus diesen Zellen eine entscheidende Rolle in diesem Malria-Toleranz-Modell zukommt. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass die Signalwirkung von Typ IFN I sowie die Produktion von IL-10 durch myeloide Zellen (hauptsächlich Makrophagen und Monozyten) entscheidend sind, um den Krankheitsverlauf zu beeinflussen: entweder in Richtung einer schwerwiegenden Verlaufsform in PbA-infizierten WT Mäusen (normale Dosis) oder in Richtung einer Toleranzentwicklung nach Infektion mit einer erhöhten Parasitendosis.