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Ein zellbasierter Biolumineszenzassay zur Untersuchung der Dimerisierung und Aggregation des Prionproteins

dc.contributor.advisorTamgüney, Gültekin
dc.contributor.authorWüsten, Katharina Annick
dc.date.accessioned2020-04-24T09:33:11Z
dc.date.available2020-04-24T09:33:11Z
dc.date.issued21.09.2017
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/20.500.11811/7269
dc.description.abstractPrionenerkrankungen wie z. B. die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit bei Menschen oder die Bovine Spongiforme Encephalopathie (BSE) bei Rindern gehören zu den neurodegenerativen Erkrankungen. Grundlage aller Prionen-Krankheiten ist das zelluläre Prion-Protein (PrPC) und die infektiöse Isoform PrPSc, die im Gegensatz zu PrPC vermehrt β-Faltblattstrukturen und Aggregate formt. Es gibt Hinweise darauf, dass PrPC Dimere bilden kann und diese eine Grundlage für die Entstehung von PrPSc-Aggregaten sein könnten. Um die Dimerisierung von PrP zu untersuchen, wurden zwei Fusionsprodukte aus PrP mit der N- bzw. C-terminalen Hälfte von Gaussia Luziferase kloniert, die an der Oberfläche von RK13 Zellen exprimiert wurden. Dimerisierte PrPC an der Oberfläche von transfizierten RK13 Zellen, komplementierten sich beide Luziferasehälften und wurden biolumineszent. Die Dimerisierung von PrPC konnte mit Antikörpern, die gegen die zentrale Region von PrPC gerichtet waren blockiert werden. Dies zeigte, dass die zentrale Region für die Dimerisierung von PrPC eine wichtige Rolle spielte. Eine Infektion der RK13-Zellen mit Hirnhomogenat erkrankter Mäuse, die sechs verschiedene mausadaptierte Prionstämme beinhalteten, führte zu einem Anstieg des Biolumineszenzsignals, während Hirnhomogenat gesunder Tiere keine Auswirkungen auf das Biolumineszenzsignal hatte. Die Behandlung mit dem Antiprion-Wirkstoff Quinacrine führte nur bei den infizierten Zellen zu einer Reduktion des Biolumineszenzsignals.
Darüberhinaus wurde die Biolumineszenzuntersuchung dazu genutzt, Wirkstoffe zu identifizieren, die gegen Prionen wirksam sein könnten. Dazu wurde eine Sammlung von 1650 Wirkstoffen verwendet. Wirkstoffe, die ohne toxisch zu sein, die Dimerisierung von PrPC inhibierten, wurden an prioninfizierten N2a-Zellen auf ihre Wirksamkeit untersucht, diese Zellen von PrPSc zu bereinigen. Dabei wurde der Wirkstoff JTC-801 identifiziert, der bereits in nanomolaren Konzentrationen die PrPSc-Menge in den infizierten Zellen senken konnte.
Die mithilfe der Biolumineszenzuntersuchung erhobenen Ergebnisse zeigten, dass das entwickelte und etablierte zellbasierte Testverfahren eine vielseitige Methode ist, um wichtige Aspekte der Prion Biologie zu erforschen.
dc.description.abstractPrion diseases like Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) are fatal neurodegenerative disorders that are triggered by misfolding of the cellular prion protein (PrPC) to an infectious isoform rich in β-sheet structure termed PrPSc. There are evidence that PrPC possibly forms dimers indicating that dimerization of PrPC may be an essential intermediate step for the formation of PrPSc aggregates upon infection.
To study PrP dimerization and PrP aggregation upon infection, a bimolecular complementation assay was developed using RK13 cells that lack endogenous PrP expression and stably expressed two fusion constructs between PrP and each half of split Gaussia luciferase. In these cells bioluminescence only occured when PrP dimerized or aggregated and the two split luciferase halves complemented each other.
Using a panel of eight antibodies directed against different PrP domains, the central domain of PrPC was identified to be critical for dimerization.
Unlike normal brain homogenate infection of RK13 cells with brain homogenates from diseased animals containing six different mouse-adapted prion strains, RML, 22L, ME7, 87V, 79A, and 22A, lead to an increase in bioluminescence. In contrast, treatment of chronically infected but not uninfected RK13 cells with the anti-prion compound quinacrine reduced bioluminescence.
Finally, a compound-screening with a compound library including 1650 bioactive compounds based on the bimolecular complementation assay identified JTC-801 as one compound that inhibited PrPC-dimerization. Treatment of ScN2a cells with JTC-801 reduced PrPSc levels in these cells at nanomolar concentrations.
Overall, these results showed that PrPC clearly dimerizes in cells and that prion infection led to increased bioluminescence in the newly developed bimolecular complementation assay. The identification of JTC-801 as a bioactive compounds that inhibited PrPC-dimerization and reduced PrPSc-levels in ScN2a cells at nanomolar concentrations suggested that PrPC dimerization may be a critical step in the conversion process of PrPC to PrPSc.
dc.language.isodeu
dc.rightsIn Copyright
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subjectPrion
dc.subjectBiolumineszenz
dc.subjectTestverfahren
dc.subjectScreening
dc.subjectPrionkrankheit
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften, Biologie
dc.titleEin zellbasierter Biolumineszenzassay zur Untersuchung der Dimerisierung und Aggregation des Prionproteins
dc.typeDissertation oder Habilitation
dc.publisher.nameUniversitäts- und Landesbibliothek Bonn
dc.publisher.locationBonn
dc.rights.accessRightsopenAccess
dc.identifier.urnhttps://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-48485
ulbbn.pubtypeErstveröffentlichung
ulbbnediss.affiliation.nameRheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
ulbbnediss.affiliation.locationBonn
ulbbnediss.thesis.levelDissertation
ulbbnediss.dissID4848
ulbbnediss.date.accepted28.06.2017
ulbbnediss.fakultaetMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
dc.contributor.coRefereeHöhfeld, Jörg


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