Identifizierung und Charakterisierung neuartiger Oxidoreduktasen in <em>Gluconobacter oxydans</em> und Produktion des potentiellen Süßstoffes 5-Keto-D-Fruktose

Abstract

Thema der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung unbekannter PQQ- und FAD-abhängiger Oxidoreduktasen, deren regiospezifische Umsetzung von Substraten in Hinblick auf die Entwicklung biotechnologischer Applikationen ein großes industrielles Potential aufweist. Über BlastP-Analysen wurden 19 nicht charakterisierte Oxidoreduktasen aus unterschiedlichen α-Proteobakterien zur Produktion und Charakterisierung ausgewählt. Es zeigte sich, dass die Produktion von periplasmatischen Oxidoreduktasen in <em>G. oxydans</em>-Stämmen möglich ist, die Proteine jedoch nicht ins Periplasma transportiert werden und daher inaktiv in der Zelle vorliegen. Im Falle der membranständigen Dehydrogenasen konnten vier Proteine erfolgreich in <em>G. oxydans</em> BP.9 produziert werden. Bei Aktivitätstest an Membranen konnten die Dehydrogenasen Ap9076 und Ap9346 aus <em>A. pasteurianus</em> als eine Aldose-Dehydrogenase und als Glukose-Dehydrogenase mit breitem Substartspektrum identifiziert werden. Des Weiteren konnte der Fruktose-Dehydrogenase-Komplex aus <em>G. japonicus</em> in <em>G. oxydans</em> 621H <em>∆hsdR</em> produziert werden, der Fruktose zu 5-Keto-D-Fruktose, einem potentiellen, neuen Süßstoff, oxidiert. Die Untereinheiten FdhS und FdhL des Proteinkomplexes konnten co-isoliert werden und wiesen eine spezifische Aktivität von 127 ± 7,7 U/mg auf. Versuche zur Umsetzung von Fruktose zu 5-Keto-D-Fruktose mit wachsenden Zellen zeigten, dass <em>G. oxydans </em>621H<em> ∆hsdR</em> fdh Fruktose mit einer durchschnittlichen Ausbeute von 92,5 ± 2% zu 5-Keto-D-Fruktose oxidierte. Zur Weiterentwicklung des Produktionsverfahrens von 5-Keto-D-Fruktose wurde ein 2-Stamm-System entwickelt, welches den Gebrauch von Saccharose als Substrat zur Generierung von 5-Keto-D-Fruktose ermöglicht. Saccharose ist in Form von Haushaltszucker um ein Vielfaches kostengünstiger als Fruktose und kommt in hohen Konzentrationen als Speicherstoff in Pflanzen vor. Mit Hilfe des 2-Stamm-Systems konnte Saccharose mit einer durchschnittlichen Ausbeute von 90,3 ± 8,6 % zu 5-Keto-D-Fruktose umgewandelt werden. In einem letzten Schritt wurde das 2-Stamm-System an industrielle Maßstäbe angepasst. Da 75-78 % der Trockensubstanz der Zuckerrübe aus Saccharose besteht, eignet sich der pflanzliche Rohstoff als Substrat zur 5-Keto-Fruktose-Produktion. Dem industriellen Vorgehen der Saccharose-Extraktion zur Zuckergewinnung nachempfunden, wurde ein Zuckerrübenextrakt erstellt und als Substrat zur 5-Keto-D-Fruktose-Produktion eingesetzt. Wachstumsversuche auf Zuckerrübenextrakt zeigten, dass die im Zuckerrübenextrakt enthaltene Saccharose durch das 2-Stamm-System mit einer durchschnittlichen Effizienz von 82 ± 5 % zu 5-Keto-D-Fruktose umgesetzt wird.