Interaktionen und Signalweiterleitung von Dectin-1 in dendritischen, tolerogenen dendritischen Zellen sowie Transfektionsmodellen

Abstract

Dectin-1 ist ein Musterkennungrezeptor auf Zellen des Immunsystem, welcher beta-Glukane in der Zellwand von pathogenen Pilzen erkennen und über Sykvermittelte Signalwege sowohl Mechanismen des angeborenen, als auch des adaptiven Immunsystems auslösen kann.<br /> In dieser Arbeit wurden neue Interaktionen und die vermittelte Signalweiterleitung des C-Typ Lektin-Rezeptors Dectin-1 untersucht. Im Detail wurde vor allem die Möglichkeit einer Interaktion von Dectin-1 mit Annexin 1 untersucht, die aufgrund von Vorversuchen in diesem Labor wahrscheinlich war. Außerdem wurde die Signalweiterleitung von Dectin-1 in Dexamethason behandelten dendritischen Zellen untersucht, welche hohe Mengen Dectin-1 exprimieren und tolerogene Eigenschaften haben. Die Ergebnisse wurden mit gewöhnlichen dendritischen Zellen verglichen. Beide Zelltypen wurden <em>ex vivo </em>aus Monozyten gesunder Spender differenziert. Im Folgenden werden die wichtigsten Ergebnisse dieser Untersuchungen zusammengefasst.<br /> Zur Untersuchung der möglichen Interkation von Dectin-1 und Annexin 1 wurden zwei verschiedene Zelllinien mit Dectin-1 bzw. Dectin-1 und Annexin 1 transfiziert. Hek293-Zellen, die mit Dectin-1 transfiziert wurden, nahmen beta-Glukane auf und transportierten diese in Kompartimente mit verringertem pH-Wert. Hek293-Zellen exprimierten geringe Mengen des möglichen Dectin-1 Interaktionspartners Annexin 1. Ausschalten des Annexin-1 Gens mittels eines CRISPR/Cas9-Plasmids führte zu einer signifikanten Verringerung der Aufnahme von FITC-Zymosan.<br /> Die Expression von Annexin 1 und Dectin-1 in Schneider Zellen führte analog zu einer erhöhten Aufnahme von FITC-Zymosan gegenüber Schneider Zellen die nur Dectin-1 exprimierten. Mit Hilfe von Immunfluoreszenz konnte weiterhin gezeigt werden, dass Dectin-1 und Annexin 1 auf phagosomalen Strukturen kolokaliseren. Dies konnte sowohl für transfizierte Schneider Zellen, als auch für dendritische Zellen gezeigt werden. Mittels Präzipitationsexperimenten konnte außerdem gezeigt werden, dass Annexin 1 in Abhängigkeit von Calciumionen an Zymosan bindet. Da Annexin 1 auch auf geschädigten Zellen externalisiert wird, wurde untersucht ob Dectin-1 an diese bindet. Dazu wurde die extrazelluläre Domäne von Dectin-1 in E. coli exprimiert und anschließend im Labormaßstab aufgereinigt. Bindungsstudien an geschädigten Jurkat-Zellen, die Annexin 1 an ihrer Oberfläche externalisierten, zeigten eine Bindung der rekombinanten extrazellulären Domäne von Dectin-1 an diese Zellen. Die Entfernung von Annexin 1 von der Oberfäche zeigte allerdings, dass weiterhin eine Bindung von Dectin-1 nachgewiesen werden konnte. Annexin 1 konnte allerdings in Eluaten detektiert werden, wenn Dectin-1 aus Lysaten doppelt transfizierter Schneider S2 Zellen mittels eines spezifischen Antikörpers präzipitiert wurde. <br /> Die Aufnahme von mit Zellfarbstoffen gefärbten geschädigten Zellen durch Dectin-1 transfizierte Hek293 wurde ebenfalls untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von Dectin-1 zu einer Erhlöhung der Aufnahme von geschädigten Zellen führt. Dectin-1 scheint eine Rolle bei der Aufnahme von geschädigten Zellen zu spielen. Die Strukturen die Dectin-1 dabei bindet, bleiben im Rahmen dieser Arbeit unklar. <br /> Die Behandlung von Patienten mit Dexamethason kann zu einem erhöhtem Risiko einer Infektion mit Pathogenen wie Pilzen führen. Es wurde gezeigt, dass Dectin-1 einer der wichtigsten Rezeptoren zur Erkennung von beta-Glukanen in der Zellwand von Pilzen ist. Die Stimulation von Dectin-1 erhöht die Produktion von Zytokinen und Chemokinen und die T-Zell-stimulatorischen Eigenschaften von dendritischen Zellen und vermittelt so die Überwindung von Pilzinfektionen.<br /> Hier wurde erstmals gezeigt, dass antigen-präsentierende Zellen, die in Gegenwart von Dexamethason generiert werden (Dex-DC), hohe Level von Dectin-1 exprimieren, keine allogenen T-Zellen zur Proliferation anregen können und eine deutliche verringerte Expression kostimulatorischer Moleküle zeigen, wenn diese mit Dectin-1 Liganden stimuliert wurden. Stimulation von Dex-DC mit beta-Glukanen löste eine starke Phosphorylierung der Kinase Syk aus und erhöhte die Sekretion von IL-10 und IL-1beta, während die Sekretion von IL-12, IL-23 und TNF-alpha reduziert war. Syk nachfolgend wurde STAT3 phosphoryliert und die nukleäre Translokation von Trankriptionsfaktoren, die die Aktivierung und Funktion von dendritischen Zellen beeinflussen, verhindert. p50, ein IL-10 induzierender Transkriptionsfaktor, wurde hingegen in hoher Konzentration in nukleären Lysaten von Dex-DC nachgewiesen. Zusätzlich kam es zu einer verstärkten Bildung von Superoxid-Anionen durch Dex-DC, die in vivo zu Gewebeschäden beitragen könnten. Die Generation von Superoxid-Anionen war Syk-, src- und Dectin-1-abhängig. Die Syk-Aktivität wird durch mehrere Phosphatasen wie CD45 und SHP-1 reguliert. In Lysaten von Dex-DC konnte eine verringerte Expression der Phosphatase SHP- 1 nachgewiesen werden, während CD45 in gleichem Maße exprimiert wurde. Insgesamt schien Dexamethason vor allem die von Dectin-1 vermittelte adaptive Immunantwort zu beeinflussen, während Mechanismen des angeborenen Immunsystems teilweise betont werden. Vermutlich spielte die Aktivierung von STAT3 über Dectin-1/Syk hierbei eine entscheidende Rolle. Dex-DC die mit dem Jak/STAT-Inhibitor Ruxolitinib vorbehandelt wurden, zeigten nach Stimulation mit LPS oder Curdlan eine deutliche Erhöhung der Expression des kostimulatorischen Moleküls CD86. Insgesamt scheinen Mechanismen des angeborenen Immunsystems in Dex-DC im Vergleich zu iDC teils verstärkt aktiviert zu werden, wenn Dectin-1 auf diesen stimuliert wurde. Dieser Befund zeigt wie wichtig die adaptive Immunantwort – wie die durch Dectin-1 vermittelte Induktion und Aktivierung von Th1/Th17 Zellen – möglicherweise bei der Kontrolle von C. albicans-Infektionen ist.<br /> Die unter Dexamethason generierten antigenpräsentierenden Zellen entsprachen in ihrem Phänotyp tolerogenen dendritischen Zellen. Tolerogene dendritische Zellen sind möglicherweise ein interessantesWerkzeug zur Vermittlung von Toleranz gegen über Selbstantigenen. Dectin-1 ist möglicherweise geeignet um Antigene in tolerogene Zellen zu schleusen und dadurch antigenspezifische Toleranz zu vermitteln. In dieser Arbeit wurde dazu das Modellprotein DQ-BSA an Zymosan angelagert und zu verschiedenen Dectin-1 exprimierenden Zellen gegeben. DC und Dex-DC zeigten eine effiziente Aufnahme von Zymosan, an das DQ-BSA angelagert wurde, über Dectin-1. Gegenüber der alleinigen Zugabe von DQ-BSA konnte ein erh¨ohte Prozessierung bei Aufnahme von DQ-BSA zusammen mit Zymosan festgestellt werden. Die Machinerie zur Prozessierung von Antigenen war demzufolge in Dex-DC nicht eingeschränkt.

Dectin-1 is a pattern-recognition receptor on cells of the immune system, which recognizes beta-glucans in the cell wall of pathogenic fungi and subsequently induces innate and adaptive immune responses via Syk-mediated signaling pathways. <br /> In this thesis new interactions and signaling of the c-type lectine receptor Dectin-1 were analyzed. In detail, the possible interaction of Dectin-1 and Annexin 1 was analyzed, which was shown to be likely as shown by previous experiments. Further, Dectin-1 mediated signaling was analyzed in dexamethasone treated dendritic cells, which express high levels of the receptor and have tolerogenic properties. These results were compared to conventional dendritic cells. Both cell types were differentiated <em>ex vivo</em> from monocytes of healthy donors. Hereinafter the main findings of the experiments is briefly presented. To assess new interaction partners of Dectin-1, two different cell lines were transfected with Dectin-1 or Dectin-1 and Annexin 1. Hek293 cells, that were transfected with Dectin-1, efficiently engulfed beta-glucans and transported them to acidic compartments. Hek293 cells expressed low levels of Annexin 1. Knockout of Annexin 1 via a CRISPR/Cas9 knockout plasmid in Hek293 reduced uptake of FITC-Zymosan significantly. The expression of Dectin-1 and Annexin 1 in Schneider cells led to increased uptake of FITC-Zymosan as compared to Dectin-1 expressing Schneider cells. With the help of immunefluorescence, we further could show, that Annexin 1 and Dectin-1 colocalized on phagosomal structures. This could be shown for double transfected Schneider cells and monocyte-derived dendritic cells. Furthermore precipitation experiments showed, that Annexin 1 could bind to Zymosan in the presence of calcium ions. As Annexin 1 is also externalized on damaged cells, we tested if Dectin-1 binds to this cells. To do so, the extracellular domain of Dectin-1 was expressed in E. coli and was subsequently purified at laboratory scale. Damaged Jurkat cells, that externalized Annexin 1 on their surface, showed binding of recombinant Dectin-1. Stripping of Annexin 1 from the cell surface did not reduce binding of Dectin-1. Nevertheless it was possible to detect Annexin 1 in eluates from precipitations of Dectin-1 from lysates of double transfected cells. Uptake of damaged cells by Dectin-1 transfected Hek293 was analyzed by using stained apoptotic cells. Transfection of Dectin-1 into Hek293 led to an increased uptake of damaged Jurkat cells. Dectin-1 seems to play role in uptake of damaged cells. The structures that are recognized by Dectin-1 remain unclear in the context of this work. <br /> Treatment of patients with glucocorticoids often results in an increased risk of infection with pathogens such as fungi. Dectin-1 was shown to be one of the major receptors for fungal beta-glucans. Activation of Dectin-1 increases the production of cytokines, chemokines and T-cell stimulatory capacity of DC and mediates resolution of fungal infections. <br /> Here we show that antigen-presenting cells generated in the presence of dexamethasone (Dex-DC) expressed high levels of Dectin-1, had a reduced capacity to stimulate T-cell proliferation and decreased expression of costimulatory molecules, that could not be enhanced upon stimulation with Dectin-1 ligands. Stimulation of Dex-DC with beta-glucans induced a strong upregulation of Syk-kinase phosphorylation and increased secretion of IL-10 and IL-1beta, while the production of IL-12, IL-23 and TNF-alpha was reduced or absent. Downstream of Syk, stimulation of Dectin-1 on Dex-DC resulted in phosphorylation of STAT3 and reduced nuclear translocalization of transcription factors involved in dendritic cell activation and function. Solely p50, a IL-10 inducing transcription factor, could be detected in nuclear lysates of Dex-DC. Additionally there was an increased generation of superoxide-anions by Dex-DC, which might contribute to tissue damage in C. albicans infection in vivo. Generation of superoxide-anions was dependent on Syk, src and Dectin-1. The activity of Syk is modulated by phosphatases like CD45 and SHP-1. In lysates of Dex-DC SHP-1 expression was redued, whereas expression of CD45 was not affected. Taken together treatment of DC with dexamethasone seemed to influence Dectin-1 mediated adaptive response, whereas mechanisms of the innate response were partly pronounced. Presumably activation of STAT3 via Dectin-1/Syk played an important role in this process. Dex-DC that were pretreated with the Jak/STAT-inhibitor ruxolitinib showed an increased expression of CD86 after stimulation with LPS or curdlan. Taken together these results showed that innate mechanisms of the immune system are pronounced compared to iDC when Detin-1 was stimulated. This findings showed how important adaptive immune response – like induction and activation of Th1/Th17 cells via Dectin-1 – might be to control infections with C. albicans. <br /> The phenotype of antigen-presenting cell generated under the influence of dexamethasone corresponds to tolerogenic dendritic cells. Tolerogenic dendritic cells are presumably an interesting tool to mediate tolerance against selfantigens. Dectin-1 might be suitable to deliver antigens into tolerogenic cells to induce antigen-specific tolerance. In this thesis the model protein DQ-BSA was coated to zymosan and different Dectin-1 expressing cells were stimulated. DC and Dex-DC showed an efficient uptake of DQ-BSA coated zymosan via Dectin-1. Compared to treamtent with DQ-BSA, there only was an increase in processing of DQ-BSA when coated to zymosan. The machinery for processing of anitgens seemed not to be affected in Dex-DC.