Bioinformatische und in-vitro-Analyse der frs-Biosynthesegencluster von Cand. Burkholderia crenata und Chromobacterium vaccinii
Dokument öffnen (21.6MB)Art der Hochschulschrift
DissertationPrüfungsdatum
15.02.2019Datum der Veröffentlichung
03.07.2019Erstgutachter
König, Gabriele M.Zweitgutachter
Knöss, WernerMetadaten
Zur Langanzeige
Zitierbare Links 
Inhalt
FR900359 (FR) ist ein selektiver Gq-Proteininhibitor, der ursprünglich aus der Pflanze Ardisia crenata isoliert wurde. G-Proteine spielen eine zentrale Rolle in der Signalübertragung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR), die an vielen physiologischen Prozessen beteiligt sind. G-Proteine sind im Vergleich zu GPCRs relativ gering erforscht, da es nur wenig membrangängige G-Protein-Modulatoren gibt. FR kann aufgrund seiner Eigenschaften diese Lücke schließen.
FR ist ein zyklisches Depsipeptid, bestehend aus 8 Einheiten, von denen 7 Aminosäuren sind. Die meisten davon sind nicht-proteinogenen Ursprungs. Einen weiteren ungewöhnlichen Baustein bildet die Carbonsäure Phenyllaktat, die über eine Esterbindung in den Heterozyklus eingebaut ist. Das Biosynthesegencluster (BGC) von FR konnte in zwei unterschiedlichen Wirtsorganismen lokalisiert werden, in Candidatus Burkholeria crenata und in Chromobacterium vaccinii. Obwohl Cand. B. crenata im Gegensatz zu C. vaccinii ein Endosymbiont ist, sind beide BGC strukturell nahezu identisch. In dieser Arbeit wurden die beiden Nichtribosomalen Peptidsyntethase BGC aus Cand. B. crenata und C. vaccinii identifiziert und bioinformatisch betrachtet. Hierzu wurden die BGC vor allem auf Gemeinsamkeiten und Unterschiede hin untersucht. Des weiteren wurden die bioinformatischen Grundlagen geschaffen, um einen neuartigen Dehydratisierungsmechanismus durch Kondensierungsdomänen (C-Domänen) zu untersuchen. Ebenfalls konnte für die letzte Adenylierungsdomäne (A-Domäne) aus FrsG (A8) eine für A-Domänen bis jetzt unbekannte Struktur postuliert werden, die sowohl zwei Methyltransferasen (MT-Domänen) als auch zwei Subdomänen enthält. Die A-Domänen aus FrsA (A1) und FrsD (A2) wurden anhand von in-vitro-Studien untersucht, um die Biosynthese der nicht-proteinogenen Aminosäure Hydroxyleucin während der FR-Biosynthese zu belegen.
Im ersten Teil der Arbeit konnte durch einen Vergleich der BGC auf DNA- und Protein-Ebene die Identität der BGC untereinander bestimmt werden. Hierbei wurde festgestellt, dass die BGC nicht nur untereinander sehr ähnlich sind, sondern sich auch innerhalb des jeweiligen BGC wiederholende Bereiche mit ausgesprochen hoher Identität befinden. Diese sind bei beiden BGC ähnlich groß und ihre Lokalisation ist übereinstimmend.Eine weitere Besonderheit der frs-BGC ist die A-Domäne A8 mit zwei aufeinander folgenden MT-Transferasen.
Durch die Analyse der Core-Bereiche der A-Domänen nach Stachelhaus konnte die ungewöhnliche Struktur der A-Domäne A8 aus FrsG genauer bestimmt werden, die nicht nur zwei MT-Domänen, sondern auch zwei A-Subdomänen enthält.
FR enthält die ungewöhnliche Aminosäure N-Methyldehydroalanin. Die frs-BGC kodieren aber für kein Enzym, das offensichtlich die Dehydratisierung von Serin zu Dehydroalanin katalysieren könnte.
Durch Alignments und anschließende Erstellung eines 3D-Modells der C-Domänen C6 und C8 konnte ein Hinweis auf einen neuen putativen Mechanismus für eine Dehydratisierung von Serin zu Dehydroalanin gefunden werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden die beiden A-Domänen von FrsA und FrsD, und damit die Hydroxyleucin-Biosynthese mithilfe des gut etablierten A-Domänen-Assay nach Phelan et al. 2009 charakterisiert. Hierzu wurden diese A-Domänen heterolog exprimiert und in einem massenspektroskopisch basierten Assay auf ihre Spezifität getestet. Dabei konnte eine eindeutige Prävalenz beider A-Domänen für Leucin gezeigt werden. Diese Erkenntnis präzisiert die bioinformatische Analyse und zeigt, dass die Hydroxygruppe enzymatisch nach dem Beladen des Peptidyl Carrier Protein (PCP) mit Leucin eingefügt wird.
Insgesamt konnten durch diese Arbeit zahlreiche Einblicke und Grundlagen in die Biosynthese von FR erhalten werden, die bei der Modifizierung dieses Wirkstoffes helfen könnten. Neue Strukturvarianten von FR durch Bioengineering können dazu beitragen, die Mechanismen der Funktion von G-Proteinen zu entschlüsseln.
Schlagwörter
Klassifikation (DDC)
570 Biowissenschaften, Biologie 615 Pharmakologie, TherapeutikOnline-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5-54953
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5-54953,
author = {{Isabella Schamari}},
title = {Bioinformatische und in-vitro-Analyse der frs-Biosynthesegencluster von Cand. Burkholderia crenata und Chromobacterium vaccinii},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2019,
month = jul,
note = {
FR900359 (FR) ist ein selektiver Gq-Proteininhibitor, der ursprünglich aus der Pflanze Ardisia crenata isoliert wurde. G-Proteine spielen eine zentrale Rolle in der Signalübertragung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR), die an vielen physiologischen Prozessen beteiligt sind. G-Proteine sind im Vergleich zu GPCRs relativ gering erforscht, da es nur wenig membrangängige G-Protein-Modulatoren gibt. FR kann aufgrund seiner Eigenschaften diese Lücke schließen.
FR ist ein zyklisches Depsipeptid, bestehend aus 8 Einheiten, von denen 7 Aminosäuren sind. Die meisten davon sind nicht-proteinogenen Ursprungs. Einen weiteren ungewöhnlichen Baustein bildet die Carbonsäure Phenyllaktat, die über eine Esterbindung in den Heterozyklus eingebaut ist. Das Biosynthesegencluster (BGC) von FR konnte in zwei unterschiedlichen Wirtsorganismen lokalisiert werden, in Candidatus Burkholeria crenata und in Chromobacterium vaccinii. Obwohl Cand. B. crenata im Gegensatz zu C. vaccinii ein Endosymbiont ist, sind beide BGC strukturell nahezu identisch. In dieser Arbeit wurden die beiden Nichtribosomalen Peptidsyntethase BGC aus Cand. B. crenata und C. vaccinii identifiziert und bioinformatisch betrachtet. Hierzu wurden die BGC vor allem auf Gemeinsamkeiten und Unterschiede hin untersucht. Des weiteren wurden die bioinformatischen Grundlagen geschaffen, um einen neuartigen Dehydratisierungsmechanismus durch Kondensierungsdomänen (C-Domänen) zu untersuchen. Ebenfalls konnte für die letzte Adenylierungsdomäne (A-Domäne) aus FrsG (A8) eine für A-Domänen bis jetzt unbekannte Struktur postuliert werden, die sowohl zwei Methyltransferasen (MT-Domänen) als auch zwei Subdomänen enthält. Die A-Domänen aus FrsA (A1) und FrsD (A2) wurden anhand von in-vitro-Studien untersucht, um die Biosynthese der nicht-proteinogenen Aminosäure Hydroxyleucin während der FR-Biosynthese zu belegen.
Im ersten Teil der Arbeit konnte durch einen Vergleich der BGC auf DNA- und Protein-Ebene die Identität der BGC untereinander bestimmt werden. Hierbei wurde festgestellt, dass die BGC nicht nur untereinander sehr ähnlich sind, sondern sich auch innerhalb des jeweiligen BGC wiederholende Bereiche mit ausgesprochen hoher Identität befinden. Diese sind bei beiden BGC ähnlich groß und ihre Lokalisation ist übereinstimmend.Eine weitere Besonderheit der frs-BGC ist die A-Domäne A8 mit zwei aufeinander folgenden MT-Transferasen.
Durch die Analyse der Core-Bereiche der A-Domänen nach Stachelhaus konnte die ungewöhnliche Struktur der A-Domäne A8 aus FrsG genauer bestimmt werden, die nicht nur zwei MT-Domänen, sondern auch zwei A-Subdomänen enthält.
FR enthält die ungewöhnliche Aminosäure N-Methyldehydroalanin. Die frs-BGC kodieren aber für kein Enzym, das offensichtlich die Dehydratisierung von Serin zu Dehydroalanin katalysieren könnte.
Durch Alignments und anschließende Erstellung eines 3D-Modells der C-Domänen C6 und C8 konnte ein Hinweis auf einen neuen putativen Mechanismus für eine Dehydratisierung von Serin zu Dehydroalanin gefunden werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden die beiden A-Domänen von FrsA und FrsD, und damit die Hydroxyleucin-Biosynthese mithilfe des gut etablierten A-Domänen-Assay nach Phelan et al. 2009 charakterisiert. Hierzu wurden diese A-Domänen heterolog exprimiert und in einem massenspektroskopisch basierten Assay auf ihre Spezifität getestet. Dabei konnte eine eindeutige Prävalenz beider A-Domänen für Leucin gezeigt werden. Diese Erkenntnis präzisiert die bioinformatische Analyse und zeigt, dass die Hydroxygruppe enzymatisch nach dem Beladen des Peptidyl Carrier Protein (PCP) mit Leucin eingefügt wird.
Insgesamt konnten durch diese Arbeit zahlreiche Einblicke und Grundlagen in die Biosynthese von FR erhalten werden, die bei der Modifizierung dieses Wirkstoffes helfen könnten. Neue Strukturvarianten von FR durch Bioengineering können dazu beitragen, die Mechanismen der Funktion von G-Proteinen zu entschlüsseln.
url = {https://hdl.handle.net/20.500.11811/7946}
}
Die folgenden Nutzungsbestimmungen sind mit dieser Ressource verbunden:
