Stiller, Lisa M.: Untersuchungen zur heterologen Biosynthese des seltenen kompatiblen Soluts Nε-Acetyl-β-Lysin. - Bonn, 2020. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5-59482
@phdthesis{handle:20.500.11811/8557,
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author = {{Lisa M. Stiller}},
title = {Untersuchungen zur heterologen Biosynthese des seltenen kompatiblen Soluts Nε-Acetyl-β-Lysin},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2020,
month = aug,

note = {Das Aminosäurederivat Nε-Acetyl-β-Lysin (NAβL) wird von methanogenen Archaeen und einigen Vertretern der Bakterien zur Anpassung an osmotischen Stress produziert. Bisher wurden vor allem die zur Produktion notwendigen Enzyme untersucht; über die Substanz ist außer der osmotischen Wirksamkeit wenig bekannt. Das liegt vor allem daran, dass der erste der beiden Syntheseschritte - die Umwandlung von α-Lysin zu β-Lysin - durch ein sauerstoffempfindliches Enzym vermittelt wird und die temporäre Einführung eines Radikals umfasst. Bislang wurde noch nicht von einer in vitro-Synthese von NAβL berichtet und die Herstellung mittels natürlicher Produzenten erweist sich in vielen Fällen als langwierig und aufwendig. Aus diesem Grund sind weitere, möglicherweise protektive und biotechnologisch interessante Eigenschaften dieses kompatiblen Soluts noch unerforscht.
In der vorliegenden Arbeit wurden erste Untersuchungen zu möglichen Auswirkungen von NAβL auf Methoden der Molekularbiologie durchgeführt. Des Weiteren stand vor allem die heterologe Produktion von NAβL in den Organismen Halomonas elongata und Escherichia coli im Fokus.
Bei der Durchführung von Restriktionsverdaus mit einem geeigneten Plasmid sorgte bereits die Zugabe von lediglich 0,5 mM NAβL für eine signifikante Verzögerung des Reaktions-Endzeitpunktes (also dem Zeitpunkt, zu dem die Plasmid-DNA restlos gespalten und somit linear vorlag). Dieser verschob sich von ca. 2 Min in der Kontrolle ohne NAβL auf ca. 60 Min mit NAβL. Eine Supplementierung von 0,5 mM NAβL zu Amplifikationen verschiedener Gene mittels Polymerase-Kettenreaktion führte zur kompletten Inhibition der Reaktionen. NAβL wird möglicherweise (ähnlich wie bspw. das kompatible Solut Ectoin) präferiert aus der Hydrathülle der hier genutzten Enzyme ausgeschlossen und stabilisiert diese so in ihrer nativen Form. Als Konsequenz würde deren Rigidität erhöht und die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich verringert werden. Das Solut könnte außerdem die freie Bindungsenergie des Komplexes aus DNA und Restriktionsenzym durch seinen zwitterionischen Charakter beeinflussen, was ebenfalls zu einer Verzögerung der Reaktion führen würde.
Für die heterologe NAβL-Produktion in H. elongata und E. coli wurden Plasmid-basierte Produktionssysteme konstruiert. Eine erfolgreiche Synthese gelang in H. elongata durch Nutzen der Gene kamA und yodP aus Bacillus subtilis. Hier konnten nach aerober Kultivierung in Minimalmedium bei 4 - 6 % NaCl Solutgehalte zwischen 1,4 und 1,6 mg/g Trockenbiomasse (TBM; entspricht ca. 6,5 bzw. 6,9 mmol/L intrazellulärem Volumen, IZV) nachgewiesen werden.
Zur NAβL-Produktion in E. coli wurden verschiedene Kombinationen aus Synthesegenen genutzt, wobei entweder kamA aus Clostridium pasteurianum oder ablA aus Methanosarcina mazei jeweils in Verbindung mit yodP aus B. subtilis verwendet wurden. Nach semi-anaerober Kultivierung in Minimalmedium bei 3 % NaCl konnten hier NAβL-Erträge bis zu 7,1 mg/g TBM (ca. 20 mM IZV) bei Nutzung der Genkombination kamACp/yodP und bis zu 50 mg/g TBM (ca. 142 mM IZV) bei Nutzung der Genkombination ablA/yodP nachgewiesen werden. Der höchste Gehalt lag bei ca. 120 mg NAβL/g TBM (intra- und extrazellulär vereint).
Darüber hinaus konnte erfolgreich die Bifunktionalität eines NAβL-Syntheseproteins aus dem grünen Nichtschwefelbakterium Dehalococcoides mccartyi CBDB1 experimentell bestätigt werden. Das Enzym AblAB vereint beide Syntheseschritte und befähigt E. coli zur heterologen Synthese von bis zu 10,7 mg NAβL/g TBM (ca. 30 mM IZV) bei semi-anaerober Kultivierung in Minimalmedium bei 3 % NaCl.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/8557}
}

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