Untersuchungen zur heterologen Biosynthese des seltenen kompatiblen Soluts N_ε-Acetyl-β-Lysin

Abstract

Das Aminosäurederivat N_ε-Acetyl-β-Lysin (NAβL) wird von methanogenen Archaeen und einigen Vertretern der Bakterien zur Anpassung an osmotischen Stress produziert. Bisher wurden vor allem die zur Produktion notwendigen Enzyme untersucht; über die Substanz ist außer der osmotischen Wirksamkeit wenig bekannt. Das liegt vor allem daran, dass der erste der beiden Syntheseschritte - die Umwandlung von α-Lysin zu β-Lysin - durch ein sauerstoffempfindliches Enzym vermittelt wird und die temporäre Einführung eines Radikals umfasst. Bislang wurde noch nicht von einer <em>in vitro</em>-Synthese von NAβL berichtet und die Herstellung mittels natürlicher Produzenten erweist sich in vielen Fällen als langwierig und aufwendig. Aus diesem Grund sind weitere, möglicherweise protektive und biotechnologisch interessante Eigenschaften dieses kompatiblen Soluts noch unerforscht. <br /> In der vorliegenden Arbeit wurden erste Untersuchungen zu möglichen Auswirkungen von NAβL auf Methoden der Molekularbiologie durchgeführt. Des Weiteren stand vor allem die heterologe Produktion von NAβL in den Organismen <em>Halomonas elongata</em> und <em>Escherichia coli</em> im Fokus. <br /> Bei der Durchführung von Restriktionsverdaus mit einem geeigneten Plasmid sorgte bereits die Zugabe von lediglich <nobr>0,5 mM</nobr> NAβL für eine signifikante Verzögerung des Reaktions-Endzeitpunktes (also dem Zeitpunkt, zu dem die Plasmid-DNA restlos gespalten und somit linear vorlag). Dieser verschob sich von ca. 2 Min in der Kontrolle ohne NAβL auf ca. 60 Min mit NAβL. Eine Supplementierung von <nobr>0,5 mM</nobr> NAβL zu Amplifikationen verschiedener Gene mittels Polymerase-Kettenreaktion führte zur kompletten Inhibition der Reaktionen. NAβL wird möglicherweise (ähnlich wie bspw. das kompatible Solut Ectoin) präferiert aus der Hydrathülle der hier genutzten Enzyme ausgeschlossen und stabilisiert diese so in ihrer nativen Form. Als Konsequenz würde deren Rigidität erhöht und die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich verringert werden. Das Solut könnte außerdem die freie Bindungsenergie des Komplexes aus DNA und Restriktionsenzym durch seinen zwitterionischen Charakter beeinflussen, was ebenfalls zu einer Verzögerung der Reaktion führen würde. <br /> Für die heterologe NAβL-Produktion in <nobr><em>H. elongata</em></nobr> und <nobr><em>E. coli</em></nobr> wurden Plasmid-basierte Produktionssysteme konstruiert. Eine erfolgreiche Synthese gelang in <nobr><em>H. elongata</em></nobr> durch Nutzen der Gene <em>kamA</em> und <em>yodP</em> aus <em>Bacillus subtilis</em>. Hier konnten nach aerober Kultivierung in Minimalmedium bei <nobr>4 - 6 %</nobr> NaCl Solutgehalte zwischen 1,4 und 1,6 mg/g Trockenbiomasse (TBM; entspricht ca. 6,5 bzw. 6,9 mmol/L intrazellulärem Volumen, IZV) nachgewiesen werden. <br /> Zur NAβL-Produktion in <nobr><em>E. coli</em></nobr> wurden verschiedene Kombinationen aus Synthesegenen genutzt, wobei entweder <em>kamA</em> aus <em>Clostridium pasteurianum</em> oder <em>ablA</em> aus <em>Methanosarcina mazei</em> jeweils in Verbindung mit <em>yodP</em> aus <nobr><em>B. subtilis</em></nobr> verwendet wurden. Nach semi-anaerober Kultivierung in Minimalmedium bei <nobr>3 %</nobr> NaCl konnten hier NAβL-Erträge bis zu 7,1 mg/g TBM (ca. 20 mM IZV) bei Nutzung der Genkombination <em>kamA_Cp/yodP</em> und bis zu 50 mg/g TBM (ca. 142 mM IZV) bei Nutzung der Genkombination <em>ablA/yodP</em> nachgewiesen werden. Der höchste Gehalt lag bei ca. 120 mg NAβL/g TBM (intra- und extrazellulär vereint). <br /> Darüber hinaus konnte erfolgreich die Bifunktionalität eines NAβL-Syntheseproteins aus dem grünen Nichtschwefelbakterium <em>Dehalococcoides mccartyi</em> CBDB1 experimentell bestätigt werden. Das Enzym AblAB vereint beide Syntheseschritte und befähigt <nobr><em>E. coli</em></nobr> zur heterologen Synthese von bis zu 10,7 mg NAβL/g TBM (ca. 30 mM IZV) bei semi-anaerober Kultivierung in Minimalmedium bei <nobr>3 %</nobr> NaCl.

<strong>Studies on the heterologous biosynthesis of the rare compatible solute N_ε-acetyl-β-lysine</strong> <br /> The amino acid derivative N_ε-acetyl-β-lysine (NAβL) is produced by methanogenic archaea and some bacteria against osmotic stress. To date, only the enzymes necessary for NAβL production have been examined, however, little is known about the substance itself apart from the osmotic efficacy. The first of two enzymatic steps - the conversion of α-lysine to β-lysine - involves an oxygen-sensitive enzyme and the temporary introduction of a radical, making it difficult to produce NAβL in vitro. The synthesis via natural producers is time consuming and elaborate in many cases, which is why further possible protective and biotechnologically interesting characteristics of this compatible solute have not been investigated yet. <br /> In this work, first experiments concerning possible effects of NAβL on molecular methods were conducted. In addition, the heterologous production of this osmolyte in the organisms <em>Halomonas elongata</em> and <em>Escherichia coli</em> was the main focus. <br /> When supplemented in a restriction digest of plasmid DNA, even <nobr>0.5 mM</nobr> NAβL delayed the reaction significantly. The moment when all plasmid DNA was digested (and therefore in a linear state) shifted from approx. 2 min without NAβL to approx. 60 min with NAβL. The supplementation of <nobr>0.5 mM</nobr> NAβL to polymerase chain reactions with several genes completely inhibited the reactions. Comparable to the compatible solute ectoine, NAβL might be preferably excluded from the hydration shell of the enzymes used here and therefore may stabilizes their native form. As a consequence, their rigidity would be increased, leading to a decreased reaction rate. The solute might also affect the free binding energy of the DNA-enzyme complex by its zwitterionic nature, leading to a delay of the reaction as well. <br /> For the heterologous production of NAβL in <nobr><em>H. elongata</em></nobr> and <nobr><em>E. coli</em></nobr>, plasmid-based production systems were created. By using the genes <em>kamA</em> and <em>yodP</em> of <em>Bacillus subtilis</em>, a successful heterologous synthesis in <nobr><em>H. elongata</em></nobr> was achieved. The aerobic cultivation in minimal medium with <nobr>4 - 6 %</nobr> NaCl led to a NAβL content between 1.4 and 1.6 mg/g dry cell weight (dcw, corresponds to approx. 6.5 and 6.9 mmol/L intracellular volume, icv, respectively). <br /> For NAβL production in <nobr><em>E. coli</em></nobr>, various genes were combined. Here, either <em>kamA</em> from <em>Clostridium pasteurianum</em> or <em>ablA</em> from <em>Methanosarcina mazei</em> was used, each in combination with <em>yodP</em> from <nobr><em>B. subtilis</em></nobr>. After semi-anaerobic cultivation in minimal medium with <nobr>3 %</nobr> NaCl, up to 7.1 mg NAβL/g dcw (approx. 20 mM icv) were detected when the gene combination <em>kamA_Cp/yodP</em> was used. This content increased up to 50 mg NAβL/g dcw (approx. 142 mM icv) when the combination <em>ablA/yodP</em> was used. The highest NAβL concentration was 120 mg/g dcw (intra- and extracellular content combined). <br /> Furthermore, the bifunctionality of a synthesis protein for NAβL from the green non-sulfur bacterium <em>Dehalococcoides mccartyi</em> CBDB1 could be confirmed experimentally. The enzyme AblAB combines both enzymatic steps; when heterologously produced in <nobr><em>E. coli</em></nobr> in a semi-anaerobic cultivation in minimal medium at <nobr>3 %</nobr> NaCl, a NAβL content of 10.7 mg/g dcw (approx. 30 mM icv) was detected.