Modulation of B cell antibody production by antigen-specific IL-10 producing regulatory T cells

Abstract

The ability of B cells to present antigen and produce antibodies has established their absolute requirement in mediating adaptive immune responses. Other key mediators of the adaptive system are regulatory T-cells (Treg) which modulate both T and B cell responses. There are currently three different Treg populations: naturally-occurring regulatory populations (nTreg) designated by the expression of the IL-2 receptor (CD25) and the transcription factor Foxp3. Alternatively there are Tr-1 and Th3 cells which are characterised by the secretion of IL-10 and TGF-β respectively. IL-10 producing T cells have been shown to regulate the adaptive immune system by inducing B cells to secrete IgG4 in a cell-contact dependent manner. The benefit of such non-inflammatory B cell responses is apparent in the hypo-responsive state of patients with allergy or helminth infections such as Onchocerciasis. The present thesis was aimed at analyzing the molecular mechanisms underlying the ability of IL-10 producing T cells to induce the production of the IgG4 by B cells. For these investigations, regulatory T cell clones (Tr-TCC) were generated from human PBMC. <br /> The initial results section provides an overview regarding the different aspects of antigen-specific Tr-TCC generation. Antigen-specificity was induced via repeated rounds of stimulation with tetanus toxoid (or <i>Onchocerca Volvulus</i> extract) alone or on combination with dexamethasone and vitamin D3 (DD3). The results show the ability of Tr-TCC to suppress tetanus-specific reactive T cells in a cell-contact independent but IL-10-dependent manner. Generated Tr-TCC were then characterised for their expression of regulatory T cell markers such as CD25 and Foxp3 and compared with isolated nTreg: interestingly the cells had overlapping phenotypes. Using B:T cell co-culture assays, generated Tr-TCC were then shown to preferentially induce B cells to secrete IgG4 and required cell-contact. Experiments also demonstrated that both memory and naïve B cells were required to produce significant levels of IgG4. Mechanistically, molecules like GITR, GITR-L, TGF-β, IL-10 and Foxp3 were shown to play an important role in the induction of this immunoglobulin. It could be shown that blocking GITR molecules selectively prevented IgG4 production as did neutralizing Abs to GITR-L, IL-10 and TGF-β. Furthermore, the prevention of IgG4 induction by anti-GITR Abs was reversed by excess rIL-10 but not rTGF- β indicating a complex relationship. The requirement of Foxp3 in this process was surprising since Tr-1 cells do not constitutively express Foxp3 and an active functional role was not previously reported. To investigate this point further, the levels of Foxp3 were measured during the generation process; here it could be shown that levels of constitutive Foxp3 increased after each round of stimulation and correlated with the ability of T cell lines to induce IgG4 in B cells. The functional requirement of this transcription factor was further shown after silencing Foxp3 in Tr-TCC using specific siRNA since Tr-TCC induced IgG2 instead of IgG4. IgG4 production was also shown using isolated nTreg from healthy untreated donors albeit weaker than Tr-TCC. In further correlation, IgG4 induction by nTreg was also GITR and IL-10 dependant. More interestingly, under the same conditions, isolated CD4+CD25- effector T cells induced the production of IgG2, a result correlating with Foxp3 silenced Tr-TCC. In the final experiments, B cell activation using Toll-like receptor stimuli affected the ability of Tr-TCC to induce IgG4 in B cells. These preliminary findings provide a hypothesis for the mechanism into how the different outcomes of Onchocerca infection occur: hypo-responsive (high IgG4 and low pathology) versus hyper-responsiveness (low IgG4, high IgE and debilitating pathology).

<strong>Modulation der B-Zell-Antikörper-Produktion von Antigen-spezifischen IL-10 produzierenden regulatorischen T-Zellen</strong><br /> Die Fähigkeit von B Zellen Antigene zu präsentieren und Antikörper zu produzieren ist die notwendige Voraussetzung um die Adaptive Immunantwort auszulösen. Andere Schlüssel- Mediatoren des adaptiven Systems sind regulatorische T Zellen (Treg), die sowohl die T- als auch die B-Zell-Reaktionen modulieren. Derzeit gibt es drei verschiedene Treg Populationen. Zum einen gibt es natürliche regulatorische T Zellen (nTreg), die durch ihre Expression des IL-2 Rezeptors (CD25) und des Transkriptionsfaktors Foxp3 charakterisiert sind. Zum anderen gibt es Tr-1 und Th3 Zellen, die durch die Sekretion von IL-10 und TGF-β charakterisiert sind. Es ist festgestellt worden, daß IL-10 produzierende T Zellen das adaptive Immunsystem regulieren, indem sie B Zellen zur Sekretion von IgG4 anregen. Diese Induktion von IgG4 ist Zell Kontakt abhängig. Der Vorteil einer solchen nicht-entzündlichen B Zell-Antwort zeigt sich am hyporesponsiven Zustand von Patienten mit Allergien oder Helminth Infektionen wie Onchozerkose. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Analyse der molekularen Mechanismen, die IL- 10 produzierende T Zellen dazu befähigen die Produktion von IgG4 durch B Zellen zu induzieren. Für diese Untersuchungen wurden regulatorische T Zell Klone (Tr-TCC) aus Human PBMC generiert.<br /> Der erste Ergebnis-Abschnitt dieser Arbeit gibt einen Überblick über die verschiedenen Aspekte von Antigen-spezifischer Tr-TCC-Generierung. Die Antigen-Spezifität wurde durch wiederholte Stimulation mit dem Tetanus-Toxoid (oder <i>Onchocerca Volvulus</i> Extrakt) allein, oder in Kombination mit Dexamethason und Vitamin D3 (DD3) induziert. Die Ergebnisse zeigen, daß die so generierten T Zellen die Fähigkeit haben die Proliferation von Tetanus-spezifischen nicht regulatorischen T Zellen zu unterdrücken. Diese Unterdrückung war Zell-Kontakt unabhängig und wird durch Zytokine wie IL-10 vermittelt. Die so erzeugten Tr-TCC wurden dann auf die Expression von regulatorischen T Zell Markern, wie CD25 und Foxp3, hin untersucht und mit nTregs verglichen. Interessanterweise wiesen die Phänotypen der Tr-TCC und nTreg Zellen einige Ähnlichkeiten zueinander auf.<br /> Mit B:T-Zell-Co-Kultur-Assays konnte dargestellt werden, daß die generierten Tr-TCCs, abhängig vom Zell-Kontakt, B Zellen zur Sekretion von IgG4 induzieren. Weitere Experimente haben verdeutlicht, daß sowohl memory und als auch naive B Zellen erforderlich sind, um eine signifikante Menge an IgG4 zu produzieren. Es konnte gezeigt werden, daß Moleküle wie GITR, GITR-L, TGF-β, IL-10 und Foxp3 eine wichtige Rolle bei der Induktion von diesem Immunglobulin spielen. Weiterhin wurde nachgewiesen, daß die Blockierung von GITR Molekülen selektiv die IgG4 Produktion verhindert, wie es auch bei neutralisierenden Antikörpern gegen GITR-L, IL-10 und TGF-β der Fall ist. Interessanterweise konnte die vom anti-GITR Antikörper induzierte IgG4 Blockade durch einen Überschuß an rekombinanten IL- 10, nicht aber durch rTGF-β rückgängig gemacht werden.<br /> Der Bedarf an Foxp3 bei diesem Prozeß war sehr überraschend, da Tr-1 Zellen Foxp3 nicht konstitutiv exprimieren und über eine aktive funktionelle Rolle dieses Transkriptionsfaktors bislang nichts bekannt ist. Um dies zu untersuchen wurde die Menge an Foxp3 während des Tr- TCC-Generierungs Prozesses gemessen. Hierbei wurde festgestellt, daß die Menge an konstitutiven Foxp3 nach jeder Stimulationsrunde zunimmt und mit der Fähigkeit von T Zellen korreliert IgG4 zu induzieren. Der funktionelle Bedarf dieses Transkriptionsfaktors konnte außerdem durch Ausschalten mit spezifische siRNAs nachgewiesen werden. Diese Tr-TCC Zellen induzierten IgG2 anstelle des IgG4.<br /> Weiterhin konnte mit Hilfe von isolierten nTreg von unbehandelten gesunden Spendern IgG4 induziert werde, jedoch in geringerer Mengen als durch Tr-TCC. In weiterer Übereinstimmung war die IgG4 Induktion durch nTreg (CD4+CD25+) ebenfalls GITR und IL-10 abhängig. Isolierte CD4+CD25- Effektor T Zellen induzierten die Produktion von IgG2, ein Ergebnis das gut mit dem „silencing“ von Foxp3 in Tr-TCC korreliert. In den letzten Experimenten konnte gezeigt werden, daß die B Zell-Aktivierung durch Toll-like-Rezeptoren die Fähigkeit von Tr-TCC beeinträchtigt IgG4 zu induzieren. Diese Ergebnisse bieten eine Hypothese, warum die Onchozerca Infektionen unterschiedlich verlaufen können: Hypo-Responsiv (hohes IgG4 und niedrige Pathologie) gegenüber dem Hyper-Responsiv (niedriges IgG4, hohes IgE und schwere Erkrankung).