Cardiac L-type calcium channels and expression of RGK proteins in mouse models associated with type 2 diabetes

Abstract

<strong>Introduction</strong>: Cardiovascular disease, such as diabetic cardiomyopathy (DCM) and resulting heart failure (HF), is a leading cause of death for diabetic patients. <br /> In ventricles of non-diabetic HF patients, whole-cell L-type calcium current density (ICaL) is unchanged, while the activity of single L-type calcium channels (LTCCs) is increased. These findings suggest changes in both expression and function of LTCCs. In contrast, in a mouse model (db/db) associated with DCM ICaL is reduced, while single-channel activity is unchanged. RGK proteins, like the diabetes-associated Rad, might be involved in LTCC regulation. Though unpublished data suggest that the ventricular expression levels of Rad protein and of the LTCC pore Cav1.2 are positively correlated in several mouse models with diabetes-associated metabolic disturbances, the effect of Rad on cardiac LTCCs in a diabetic context is unclear. The current study aims at elucidating whether there is an unifying mechanism of Rad on LTCCs in diabetic hearts.<br /><strong>Methods</strong>: Two of the previously screened mouse models were more thoroughly investigated at an age of 16 and 28 weeks: leptin-deficient obese ob/ob mice and mice lacking insulin receptor substrate 2 (IRS 2). Ventricular ICaL was obtained by patch-clamp recordings and compared to those of wildtype littermates in the context of Rad and Cav1.2 mRNA and protein expression. Rad-knockout (k.o.) mice were investigated to reveal the maximum effect of an in vivo loss of Rad protein on LTCC regulation. In order to further evaluate the role of Rad in ob/ob mice, we analyzed ob/ob mice lacking Rad. <br /><strong>Results</strong>: Data obtained from Rad-k.o. mice confirm the inhibitory function of Rad protein on LTCCs and furthermore indicate an age-dependent effect. In older ob/ob mice both, Rad and Cav1.2 expression were significantly upregulated at the protein level, while ICaL was unaltered suggesting a “Cav1.2-antagonistic” function of Rad. ICaL recordings in ob/ob myocytes lacking Rad (ob/ob x Rad-k.o.) further suggest that the role of Rad is similar on a wildtype or an ob/ob background. In younger IRS 2-k.o. mice ICaL was significantly decreased. Since Rad and Cav1.2 protein expression appeared to be unchanged another mechanism underlying the decreased current density has to be assumed. In comparison to younger IRS 2-k.o. mice older mice of the same genotype showed a significantly increased ICaL. The finding that at an age of 28 weeks Cav1.2 protein expression was unaltered, while Rad protein expression was significantly reduced indicates an (age-dependent) loss of LTCC inhibition by Rad in IRS 2-k.o. mice. It is tempting to speculate that this is to compensate for the reduced ICaL observed at younger age.<br /><strong>Summary</strong>: The current study indicates an interaction between Rad and LTCCs in two diabetic mouse models. However, there appears to be no uniform, diabetes-associated mechanism of Rad-Cav1.2 interaction possibly explained by differences in the underlying pathomechanisms. The current study confirms the functional relevance of Rad expression. Thus RGK proteins appear to be promising targets to develop therapeutic strategies for the treatment of cardiac diseases involving LTCCs.

<strong>Kardiale L-Typ-Calciumkanäle und Expression von RGK-Proteinen in Typ 2 Diabetes- assoziierten Mausmodellen</strong><br /><strong>Einleitung</strong>: Herz-Kreislauf-Erkrankungen, wie z. B. die Diabetische Kardiomyopathie (DCM) und die daraus resultierende Herzinsuffizienz (HI), gehören zu den Haupttodesursachen bei Diabetikern. <br /> Bei nicht-diabetischen HI-Patienten ist die Aktivität einzelner ventrikulärer L-Typ-Calciumkanäle (LTCC) signifikant erhöht bei andererseits unveränderter Ca2+-Stromdichte, was auf Änderungen von Expression und Funktion der LTCC hindeutet. Im Gegensatz dazu zeigte sich in einem Mausmodell (db/db) der DCM eine reduzierte Ca2+-Stromdichte bei unveränderter Einzelkanalaktivität. RGK-Proteine, wie das Diabetes-assoziierte Rad, können an der LTCC-Regulation beteiligt sein. Obwohl unveröffentlichte Daten auf eine positive Korrelation der ventrikulären Proteinexpressionsniveaus von Rad und der LTCC-Pore Cav1.2 in verschiedenen Mausmodellen mit Diabetes-assoziierten Störungen hinweisen, ist der (funktionelle) Effekt von Rad auf kardiale LTCC in einem diabetischen Kontext unklar. Das Ziel dieser Studie war es, Hinweise dafür zu finden, ob es eine für diabetische Herzen charakteristische Wechselwirkung von Rad und LTCC gibt.<br /><strong>Methoden</strong>: Es wurden zwei der zuvor gescreenten Mausmodelle im Alter von 16 und 28 Wochen weiterführend untersucht: Leptin-defiziente, fettleibige ob/ob-Mäuse und Mäuse mit einem Knockout (k.o.) des Insulin-Rezeptor-Substrats 2 (IRS 2). Mittels Patch-Clamp-Methode wurden ventrikuläre LTCC-Stromdichten analysiert und mit denen von Wildtyp-Mäusen verglichen. Zusätzlich wurde die ventrikuläre mRNA- sowie Proteinexpression von Rad und Cav1.2 ermittelt. Rad-k.o.-Mäuse sollten weiterhin die maximale Wirkung eines Verlustes von Rad-Protein auf die LTCC-Regulation zeigen. Um die Rolle von Rad in ob/ob-Mäusen zu bewerten, analysierten wir ob/ob-Mäuse mit einem k.o. des Rad-Proteins. <br /><strong>Ergebnisse</strong>: Die Daten von Rad-k.o.-Mäusen bestätigen die hemmende Funktion von Rad auf LTCC und deuten darüber hinaus auf einen altersabhängigen Effekt hin. Bei den älteren ob/ob-Mäusen waren sowohl die Rad- als auch die Cav1.2-Proteinexpression signifikant hochreguliert. Die andererseits unveränderte Ca2+-Stromdichte ist somit durch eine "Cav1.2-antagonistische" Funktion von Rad erklärbar. Ganzzellaufnahmen von Kardiomyozyten Rad-defizienter ob/ob-Mäuse (ob/ob x Rad-k.o.) zeigen außerdem, dass die Rolle von Rad auf einem Wildtyp- und einem ob/ob-Hintergrund ähnlich zu sein scheint. Bei jungen IRS 2-k.o.-Mäusen war die Ca2+-Stromdichte signifikant verringert. Da die Rad- und Cav1.2-Proteinexpression unverändert war, ist davon auszugehen, dass der verminderten Stromdichte ein anderer Mechanismus zugrunde lag. Im Vergleich zu jungen IRS 2-k.o.-Mäusen zeigten ältere Mäuse des gleichen Genotyps eine signifikant erhöhte Ca2+-Stromdichte bei unveränderter Cav1.2-Proteinexpression. Eine zugleich signifikant reduzierte Rad-Proteinexpression deutet auf einen (altersabhängigen) Verlust der LTCC-Hemmung durch Rad hin und kann als Versuch interpretiert werden, die in jungem Alter reduzierte Ca2+-Stromdichte zu kompensieren. <br /><strong>Schlussfolgerung</strong>: Die aktuelle Studie deutet auf eine Interaktion zwischen Rad und LTCC in zwei diabetischen Mausmodellen hin. Allerdings scheint es keine einheitliche, Diabetes-assoziierte Wechselwirkung zu geben. Dies könnte auf Unterschiede in den zugrunde liegenden Pathomechanismen zurückgeführt werden. Die Arbeit bestätigt die funktionelle Relevanz von Rad für die ventrikuläre LTCC-Expression und Calciumströme. RGK-Proteine sind daher vielversprechende Targets für die Entwicklung therapeutischer Strategien bei der Behandlung von Herzkrankheiten, an denen LTCC beteiligt sind.