In dieser Arbeit sollte anhand der Mutationen von menschlichem Cx31 und Maus Cx45, zum einen die funktionelle Bedeutung der Mutationen, die auf unterschiedlichen Domänen lokalisiert sind, und ihr dominanter Effekt auf die Funktion der Wildtyp-Proteine untersucht werden, und zum anderen der mögliche Zusammenhang zwischen den Mutationen und den Cx-bedingten Krankheiten hergestellt werden. <br /> Verschiedene Mutationen des Cx31-Gens wurden in der Haut von Patienten mit der Hautkrankheit Erythrokeratodermia variabilis identifiziert. Um den Zusammenhang zwischen den Mutationen und den Symptomen herzustellen, wurden Mutanten, bei denen Aminosäuren verändert waren, die bei allen Connexinen der ß-Klasse konserviert sind, in die HeLa-Zellen transfiziert und charakterisiert. Es wurde festgestellt, dass die Expression der mutierten hCx31 G12R-Proteine eine Letalität der HeLa-Zellen zufolge hatte (Diestel et al., 2002). Deshalb wurden die mutierte Cx31 G12R- und C86S-cDNS in die HeLa-Zellen mit Cx31-WT transfiziert und die Doppeltransfektanten charakterisiert. In Immunofluoreszenz-Analysen wurde festgestellt, dass sowohl Cx31-WT-, als auch mutierte Cx31-Proteine an den Kontaktmembranen lokalisiert sind. Bei den Doppeltransfektanten mit Cx31-WT und G12R, bzw. C86S wurde nicht nur erhöhte Durchlässigkeit der Farbstoffe Lucifer Yellow und Neurobiotin, sondern auch ein Transfer der Farbstoffe Ethidiumbromid und Propidiumjodid festgestellt, im Gegensatz zu der HeLa hCx31WT Einfachtransfektante. Dieser dominant positive Effekt auf die Durchlässigkeit der Kanäle wurde besonders bei dem Verhältnis 1:0,15-0,3 von Cx31-WT und Mutanten deutlich. Bei den Doppeltransfektanten von HeLa rCx43/G12R wurde festgestellt, dass die Cx43-WT-Proteine teilweise die erhöhte Kopplung der mutierten Cx31-Proteine reduzieren können, wie hinsichtlich des immer noch erhöhten Farbstofftransfers festgestellt wurde. Daraus kann man schließen, dass die Mutationen G12R am N-Terminus und C86S in der 2. Transmembrandomäne des Cx31-Proteins eine Konformationsänderung und damit erhöhte Kopplung verursachen, wobei dieser Effekt durch Cx43-WT kompensiert werden konnte und sogar G12R und C86S einen transdominanten Effekt auf die Funktion der Cx43-Proteine ausüben (gain of function). <br /> C122 ist eine Mutante von Maus Cx45, bei der 26 Aminosäuren mit 9 Seinresten am CTerminus deletiert sind. Der größte Teil der C122-Proteine in HeLa C122-Transfektanten ist im perinukleären Raum lokalisiert und zeigt keine Kopplung mit dem Farbstoff Lucifer Yellow. Um die funktionelle Rolle von C122 und seinen möglichen dominanten Effekt zu untersuchen, wurde die deletierte Cx45, C122-cDNS in die HeLa-Zellen mit Cx45-WT transfiziert und die Doppeltransfektanten charakterisiert. Bei den Doppeltransfektanten mit Cx45-WT und C122 wurde eine reduzierte Durchlässigkeit des Farbstoffs Lucifer Yellow und Neurobiotin festgestellt, im Vergleich zur HeLa mCx45 Einfachtransfektante. Dieser dominant negative Effekt auf die Durchlässigkeit der Kanäle korreliert direkt mit der C122- Expression. Die Immunofluoreszenz-Analyse zeigte, dass der Membrantransport von Connexin-Proteinen auch direkt abhängig von den C122-Mengen in Doppeltransfektanten ist, wobei die Halbwertszeit und die Oligomerisierung von Cx45 und C122 kaum Unterschiede zeigten. Daraus kann man schießen, dass der C-Terminus von Cx45 für den Transport und die Funktion wichtig ist und einen dominant positiven Effekt auf den Transport von C122 ausüben kann und damit der funktionelle Defekt der C122-Proteine durch HeLa Cx45-WTProteine aufgehoben werden kann....

Membranen eukaryontischer Zellen und ihrer Organellen sind aus einer Vielzahl von verschiedenen Lipid- und Proteinmolekülen zusammengesetzt. Dabei kann es innerhalb der Membranhälften der Lipiddoppelschicht zu einer ...

Spinale Muskelatrophie, die zweithäufigste autosomal rezessive Erbkrankheit mit Todesfolge beim Menschen, wird durch Mutationen im SMN1-Gen verursacht, die zu einem Mangel an funktionellem SMN-Protein in den Zellen führen. SMN besitzt eine konservierte Tudor-Domäne und lokalisiert im Cytoplasma und im Zellkern. Das Protein ist Teil makromolekularer Komplexe und wird für die Zusammenlagerung der spleißosomalen snRNPs und vermutlich auch anderer RNA-Protein-Partikel benötigt. Am Anfang dieser Arbeit stand die Frage, ob es verwandte Proteine von SMN im Menschen mit einer möglicherweise ähnlichen Funktion gibt. Durch Datenbanksuchen wurden zwei bisher unbekannte, ubiquitär exprimierte Gene entdeckt, die für Proteine mit signifikanter Homologie zu SMN codieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung dieser Proteine. <br /> Das SMN related protein (SMNrp), das erste der beiden, besteht aus 238 Aminosäuren, und lokalisiert im Zellkern. Hier wird es an Perichromatinfibrillen gefunden, die als aktive Bereiche der Transkription und des prä-mRNA-Spleißens gelten. SMNrp ist mit dem spleißosomalen 17S-U2-snRNP assoziiert. Es konnte in vitro und in vivo gezeigt werden, dass das Protein ein essentieller Spleißfaktor ist, der noch vor der ersten Transesterifizierungsreaktion des mehrschrittigen Prozesses benötigt wird. Daneben hat SMNrp möglicherweise auch eine Funktion bei der Aktivierung der Transkription. So wurde durch Two-Hybrid-Screen die Histon-Acetyltransferase GCN5-S als putativer Interaktor von SMNrp identifiziert. Bindungsstudien zeigen, dass die Tudor-Domäne von SMNrp für die Bindung an GCN5-S benötigt wird. SMNrp hat einen bedeutenden Einfluss auf die Acetylierungsaktivität von GCN5-S. Ein SMNrp-GCN5-S-Komplex ist in der Lage, in vitro Histone zu acetylieren, die in Nucleosomen verpackt sind. Dieses eigentliche in-vivo-Substrat der Acetyltransferase kann von GCN5-S alleine nicht modifiziert werden. Demnach könnte SMNrp ein Cofaktor von GCN5-S im Zellkern sein, der die katalytische Aktivität des Enzyms entscheidend moduliert. Mit seiner Rolle beim Spleißen und vermutlich auch bei der Transkriptionsaktivierung wurde mit SMNrp ein Protein beschrieben, das, wie auch das homologe SMN, offenbar verschiedene Funktionen in der Zelle hat. <br /> Das Tudor and UBA domain-containing protein (TUBA), das zweite der beiden neu entdeckten Proteine, besteht aus 744 Aminosäuren und lokalisiert im Zellkern und im Cytoplasma. Über seine Ubiquitin-assoziierte (UBA-) Domäne bindet TUBA in vitro spezifisch an Lys₄₈-verknüpfte Ubiquitin-Ketten. In der Zelle interagiert TUBA dadurch vermutlich mit Proteinen, die für den Abbau am 26S-Proteasom markiert sind. Darüberhinaus konnten noch weitere Interaktionspartner von TUBA identifiziert werden: Über seinen N-Terminus bindet TUBA an die erst kürzlich entdeckte DNA-Topoisomerase-III-beta (TOP3β). Die Bedeutung dieser Interaktion ist noch unklar. So zeigt TUBA keinen Einfluss auf die katalytische Aktivität von TOP3b in Decatenierungsexperimenten. Außerdem wurden FMRP, das Produkt des Krankheitsgens des Fragilen-X-Syndroms, und seine Homologen FXR1 und FXR2 als TUBA-Interaktoren identifiziert. TUBA und FMRP zeigen ein ähnliches Sedimentationsverhalten bei der Dichtegradienten-Zentrifugation und colokalisieren partiell im Cytoplasma. Ein Einfluss von TUBA auf die Funktion von FMRP als Inhibitor der Translation in vitro konnte nicht nachgewiesen werden. Interessanterweise kann aber die Austauschmutante FMRP-I304N nicht mehr mit TUBA interagieren. Diese Mutante stammt aus einem Patienten mit einem stark ausgeprägten Fragilen-X-Syndrom. Der beobachtete TUBA-Bindungsdefekt könnte daher eine Rolle bei der Entstehung der Krankheitssymptome spielen....

<p>Nach heutigen Kenntnissen existieren zwei ER- und drei Golgi-residente α1,2-Mannosidasen, die am „frühen“ Oligosaccharid-Processing von N-Glykoproteinen beteiligt sind. Im Gegensatz zu den beiden ER-Mannosidasen, die ...

<p>Dem ATP-Binding-Cassette(ABC)-Transporter P-Glykoprotein (P-gp) kommt aufgrund seiner Rolle bei der so genannten Multridrug-Resistenz(MDR) von Tumoren eine große pharmazeutische Bedeutung zu. Dennoch konnte bis heute ...

<p>Keratins are major cytoskeletal proteins of epithelia, organized in two large gene families of 28 (type I) and 26 (type II) members spanning 1.2 Mb and 0.68 Mb of genomic loci, respectively. Their expression is tightly ...

Die Ergebnisse der Arbeit zur Untersuchung der funktionellen Charakterisierung von frühen Graviperzeptionsmechanismen in Pflanzen leistet einen wesentlichen Beitrag zur Aufklärung der sehr frühen Prozesse der Schwerkraft ...

<p>Ceramide (e.g. (2S,3R,4E)-2-Octadecanoylamino-octadec-4-en-1,3-diol) is a structural component of membrane glycosphingolipids and sphingomyelin, and occurs in free form as well as bound to proteins in the human skin ...

Nicotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChR) sind ligandgesteuerte Ionenkänale, die sich aus fünf Untereinheiten zusammensetzen. Durch die Kombination verschiedener Untereinheiten (α1-α10, β1-β4, γ, δ ε) entstehen zahlreiche Subtypen (z. B. α4/β2*, α3/β4*, α7* oder der muskuläre Subtyp), die unterschiedliche Verteilung und Funktionen im zentralen und im peripheren Nervensystem sowie in einigen nicht-neuronalen Zelltypen besitzen. Sie sind an zahlreichen komplexen physiologischen Prozessen beteiligt, wie z. B. kognitiven Vorgängen, Bewegungsabläufen und der Schmerzwahrnehmung. Funktionsstörungen der nAChR werden eindeutig mit neurodegenerativen Erkrankungen, der Nicotinabhängigkeit, Entzündungen und Krebs in Verbindung gebracht. Daher sind nAChR zu interessanten Targets für die Arzneistoffforschung geworden.<br /> Das im 19. Jahrhundert entdeckte Cytisin ist zu einer sehr wichtigen Leitstruktur für die Entwicklung von bioaktiven Verbindungen geworden. Im Cytisinmolekül liegt eine mit einem 2-Pyridonring verbundene Bispidinteilstruktur vor, die als Ausgangsverbindung für die Synthese von Liganden für verschiedene biologische Targets untersucht wurde, u. a. für den nAChR.  Diese Teilstruktur ist durch eine zweifache Mannich-Reaktion aus N-tBoc-4-piperidon, Formaldehyd und Benzylamin mit anschließender Reduktion der Carbonylgruppe synthetisch zugänglich, wobei man N-Benzyl-N’-tBoc-bispidin als Zwischenprodukt erhält. Einfach geschütztes Bispidin, im Besonderen N-tBoc-Bispidin, diente, nach der Abspaltung der Benzylschutzgruppe, als Ausgangsverbindung für die Synthese von verschiedenen Bispidin-Derivaten. Durch die Abspaltung der tBoc-Schutzgruppe und die Fällung als Fumarat konnten neue Bispidin-Derivate in einer fünf- bis sechsstufigen Synthese in hohen Ausbeuten und Reinheiten hergestellt werden.<br /> Die erhaltenen Bispidinamide, -sulfonamide und Harnstoffderivate wurden in Radioligand-Bindungsstudien (Kompetitionsexperimente) auf ihre Affinität zu verschiedenen nAChR Subtypen getestet, wobei [³H]Epibatidin (α4/β2*, α3/β4*, muskulärer Subtyp) und [3H]Methyllycaconitin (α7*) als Radioliganden und Membranpräparationen aus nativem Gewebe (Rattenhirn, Kalbs- oder Schweinenebenniere und Torpedo californica electroplax) verwendet wurde. N-tBoc-Bispidin interagierte ebenfalls mit dem nAChR (z. B. Ki = 45 nM für α4/β2*). Das einfachste Amidanalog des Bispidins, Acetylbispidin, zeigte hohe Affinität für α4/β2* (Ki = 5.6 nM). Weitere Verbindungen dieser Klasse zeigten ein sehr breites Affinitätsspektrum (z. B. Ki-Werte von 1.2 nM bis > 10,000 nM für α4/β2*), wodurch wichtige Hinweise für Struktur-Wirkungsbeziehungen gewonnen wurden. Der bioisostere Austausch der Amidgruppe gegen eine Sulfonamidgruppe führte zu einer geringeren oder zu einem Verlust der Affinität, z. B. Mesylbispidin mit einem Ki-Wert von > 5,000 nM für α4/β2*.<br /> In einem Teilprojekt wurden drei bekannte Cytisinderivate in größeren Mengen und hoher Reinheit für funktionelle Untersuchungen (patch-clamp Technik) und Tierversuche zu antidepressivem Verhalten bei Mäusen zur Verfügung gestellt. Sowohl die Extraktion des (-)-Cytisins aus den Samen des Goldregenbaumes (Laburnum anagyroides) als auch die anschließende vierstufige Synthese, die die Verwendung von Schutzgruppen, eine Bromierungsreaktion und eine palladiumkatalysierte Kreuzkupplungsreaktion (Suzuki-Miyaura) in einem Mikrowellenreaktor beinhaltete, konnten im Hinblick auf eine effizientere Reaktionsführung verbessert werden. 3-(Pyridin-3-yl)-Cytisin zeigte dabei eine schwache, partialagonistische Wirksamkeit am α4/β2* Subtyp, eine nur geringe Aktivierung anderer nAChR Subtypen und stärkere antidepressive Effekte in Mausmodellen zu antidepressivem Verhalten als Cytisin und kann deshalb als neue Leitstruktur für die Entwicklung von neuartigen Antidepressiva angesehen werden....
<strong>Bispidine Derivatives as Novel Ligands for the Nicotinic Acetylcholine Receptors : Synthesis, In vitro Pharmacology and Structure-Activity Relationships</strong><br /> Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are ligand-gated ion channels which are composed of five subunits. The combination of different subunits (α1-α10, β1-β4, γ, δ ε) lead to several subtypes (e.g. α4/β2*, α3/β4*, α7*, muscular subtype) which have various distribution and functions in the central and the peripheral nervous system as well as in some non-neuronal cell types. They participate in many complex physiological processes, e.g. cognitive function, motor processes or pain perception. Dysfunction of nAChRs are unequivocally related to neurodegenerative diseases, tobacco dependence, inflammation or cancer. Thus, the nAChRs have been shown to be interesting targets for drug development. <br /> Cytisine discovered in the 19th century is an invaluable template in the development of bioactive compounds. Particularly its bispidine framework which is fused to a 2-pyridone moiety has been used as a core structure for the synthesis of ligands for numerous biological targets including nAChRs. It is accessible by a double Mannich reaction from N-tBoc-4-piperidone, formaldehyde and benzylamine and subsequent reduction of the carbonyl group yielding N-benzyl-N’-tBoc-bispidine. The N-protected bispidine, especially N-tBoc-bispidine after cleavage of the N-benzyl protecting group, served as starting material for the synthesis of diverse bispidine analogs. New Bispidine derivatives could be obtained in five to six steps with high chemical yields and purities after the cleavage of the tBoc protective group and the precipitation as a fumaric acid salt.<br /> The obtained bispidine amides, sulfonamides and urea derivatives were tested for their affinities for different nAChR subtypes by competition assays with [³H]epibatidine (α74/β2*, α3/β4*, muscle type) and [3H]methyllycaconitine (α7*), respectively, using membrane fractions of native tissues (rat brain, calf/pig adrenals and Torpedo californica electroplax). N-tBoc-bispidine itself interacts with nAChRs, e.g. Ki: 45 nM for α4/β2*. The simplest amide analog, acetyl bispidine, displayed high affinity for α4/β2* (Ki: 5.6 nM), whereas other amide analogs showed a broad affinity spectrum, e.g. Ki values from 1.2 nM to > 10,000 nM for α4/β2*, which provided important insight into structure-affinity relationships. Bioisosteric replacement of the amide group for a sulfonamide group yielded less active or inactive compounds, e.g. mesyl bispidine with a Ki value > 5,000 nM for α4/β2*.<br /> In an additional project, three known cytisine derivatives have been synthesized in higher amounts and with high chemical purity and made available for further functional studies (patch clamp technique) and studies in animal models for antidepressant-like effects in mice. The extraction of (-)-cytisine from seeds of the golden rain tree (Laburnum anagyroides) as well as the subsequent four step synthesis, which included the use of a protective group (tBoc), a bromination and a palladium-catalysed cross-coupling reaction (Suzuki-Miyaura) in a microwave reactor, could be improved with regard to a greater synthetic efficiency. 3-(Pyridin-3’-yl)-cytisine displayed weak effects as a partial agonist for the α4/β2* subtype, only a small activation to other nAChR subtypes and stronger antidepressant-like effects in mice compared to cytisine. Thus, 3-(Pyridine-3’-yl)-cytisine can be seen as a new lead structure for the development of drugs to treat mood disorders....

In dieser Arbeit wurden Funktionen von definierten Epitopen der cytosolischen Domänen von NCAM140 und NCAM180, der beiden Transmembran-Isoformen des neuralen Zelladhäsionsmoleküls, untersucht.<br /> Durch den Austausch des ...